家禽脂质代谢相关基因及miRNAs研究进展

2021-03-05李菁菁林中珍黎志强刘益平

四川农业大学学报 2021年1期

李菁菁，林中珍，黎志强，刘益平

（四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，成都 611130）

脂肪是机体储存能量的主要来源，当摄入的能量高于机体需要量时，多余的能量会转化成脂肪储存起来，调节脂肪的动态平衡[1]。根据分布部位的差异，脂肪可以分为腹部脂肪，皮下脂肪和肌内脂肪。在家禽中，过多的腹脂沉积不仅会降低饲料转化率和胴体品质，而且由于脂肪较难处理,易造成环境污染[2]。肌内脂肪是指分布在肌肉组织中肌纤维间的脂肪，主要分布于肌外膜、肌束膜以及肌内膜上。研究表明，肌内脂肪与肌肉的风味品质和食用价值有很大的关系，是影响肉质的重要因素[1]。一方面，肌束间积聚的脂肪能够疏松结缔组织，造成肌肉纤维束易分离，肌肉变得柔软细腻，适口性强。肌内脂肪在氧化时有溶解肌纤维束的作用，进一步提高肌肉嫩度和多汁性[2]；另一方面，脂质是鸡肉中主要的风味前体物质,煮熟的鸡肉通过脂质降解而产生数百种挥发性化合物，包括烃、醛、醇、酮、酯、羧酸、芳烃和烷基呋喃等[3]。动物机体内的脂肪主要以甘油三酯（triglyceride，TG）和磷脂两种形式存在。肌内脂肪富含携带大量多不饱和脂肪酸的磷脂，而腹脂的主要成分是TG。D.S.Mottram等[4]对磷脂和TG在肉品风味形成的作用进行了研究，结果发现，利用石油醚去除TG后，肉的风味基本没有发生变化，但当用氯仿甲醇同时去除TG和磷脂时，肉香显著变淡，表明磷脂在风味形成中具有更重要的作用。

动物体脂沉积是一个动态平衡的过程，主要由脂肪酸（fatty acid，FA）的合成、转运及分解三个阶段共同调节完成的[5]。家禽体内脂肪的吸收转运有两种途径，一是采食后，食物中的脂质物质经过一系列消化过程后被胆汁酸乳化，在小肠中形成乳糜颗粒。乳糜微粒经肠黏膜进入血液循环系统，经脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）水解，释放出游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）。第二种途径是机体自身的从头合成[6]。哺乳动物的脂肪合成主要在肝脏和脂肪组织中，而家禽90%的脂肪都在肝脏合成[7]。在家禽肝脏内，葡萄糖在糖酵解及丙酮酸分解作用下产生乙酰CoA，乙酰CoA羧化酶作用于乙酰CoA产生丙二酸单酰CoA，在脂肪酸合成酶（atty acid synthase，FAS）的催化下生成软脂酸，软脂酸再经过加工生成FA。甘油与FA作用形成TG，再结合载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）形成极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL），通过血液循环系统被转运到脂肪组织中贮存和利用[7]。脂肪的分解主要是指TG的分解，当机体需要能量时，储存的TG能在激素敏感酯酶（hormonesensitive lipase，HSL）、甘油三酯脂酶（adiposetriglyceridelipase，ATGL）等的作用下逐步变为FFA和甘油，生成的物质在释放进入血液后通过血液运输至机体其他组织被氧化利用[8]。代谢产生的FFA通过β-氧化生成乙酰CoA进入三羧酸循环进一步供能。

脂肪形成由未分化的间充质前体分化为前脂肪细胞，然后经历二次分化阶段，成为成熟的脂肪细胞[9]。目前，脂肪细胞及肌内脂肪细胞来源及其分化沉积调控等已成为研究热点之一。本文主要对调控鸡脂质代谢的关键基因、miRNAs、信号通路等分子机制的相关研究进展进行综述。

1 参与脂质代谢相关基因

脂肪合成相关关键酶包括乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS），二酰甘油转移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）等；而脂肪分解相关的酶主要有 LPL、ATGL、HSL 等[8，10-12]。在家禽生长过程中，一系列基因及转录因子共同调控脂质代谢。

1.1 PPARs基因家族

在脂质代谢中研究得比较深入的是过氧化物酶体增殖物激活型受体（peroxisome proliferator activated receptor，PPARs）基因家族。它是一类配体依赖性转录因子，能被内源性脂肪酸和脂肪酸代谢物，以及一些合成激活剂，包括贝特类药物和噻唑烷二酮类药物激活[13]。它们由A-F 6个保守结构域构成[14]。活化的PPARs和类视黄醇X受体（Retinoid X receptor，RXR）形成 PPAR-RXR 异二聚体，高度保守的中心DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD）（C结构域）与靶基因启动子区域中过氧化物酶体增殖物反应元件（peroxisome proliferators responsive element，PPRE）的特定DNA序列结合，从而调控FA的摄取，运输和氧化[15]。目前已知的PPARs基因亚型有3种：PPARα、PPARβ和PPARγ。与哺乳动物一样，家禽的PPARα在肝脏中高表达，并且在禁食期间对能量和脂质代谢的稳态起着重要作用[16]。PPARα调控参与多种与脂质代谢相关途径相关的基因的表达，包括微粒体、过氧化物酶体和线粒体中的FA氧化，FA结合和活化，FA延伸和去饱和，TG的合成和分解，脂蛋白代谢，糖异生，胆汁酸代谢等代谢途径[17-19]。在哺乳动物中，PPARα可通过上调酰基辅酶A 合成酶（acyl-CoA synthetase，ACS），肉碱棕榈酸转移酶-I（carnitine palmitate transferase-I，CPT-I）和肉碱棕榈酸转移酶-II（carnitine palmitate transferase-II，CPT-II）来促进细胞FA的摄取和FA的β氧化，从而降低FFA的水平[20]。为了探究蛋鸡中PPARα对肉碱稳态的调节，M.Shibani等[21]在蛋鸡饲料中添加PPARα激活剂氯贝丁酯，结果表明添加氯贝丁酯后，不仅肝脏中的肉碱浓度增加，血浆、蛋黄和蛋白中的肉碱浓度也同时增加。此外，添加氯贝丁酯后，肝脏中PPARα的靶基因CPT-I和酰基CoA氧化酶（acyl-CoA oxidase，ACO）的表达增加，表明 PPARα的激活。同时，肉碱转运蛋白新型有机阳离子转运蛋白（carnitine/organic cation transporter-2，OCTN-2）的mRNA表达量也显著增加，表明PPARα通过介导OCTN-2促进肉碱从血浆吸收转运进入肝细胞造成机体肉碱含量增加。PPARβ在脂质代谢中的相关研究较少，而大量研究表明PPARγ是诱导脂肪细胞分化的特异性转录因子，可调控大量与脂质代谢相关的基因，对脂肪生成起到了重要作用[22]。Wang Y.等[23]研究表明，在鸡前体脂肪细胞中，干扰PPARγ有效地促进了鸡前体脂肪细胞增殖并抑制了鸡前脂肪细胞的分化。Sun Y.等[24]发现PPARγ表达量在高低脂系鸡的腹脂重存在显著差异，且在PPARγ启动子区域中-548，-435和-383 bp处的3个CpG岛在低脂系和高脂系鸡之间存在甲基化差异，并且鸡PPARγ的表达也受到DNA甲基化的调节。

1.2 FABPs基因家族

脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding proteins，FABPs）是机体内调控脂肪代谢的重要因子，主要包括脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）、心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）、肝脏型脂肪酸结合蛋白（LFABP）、小肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）、内皮型肝脏型脂肪酸结合蛋白（E-FABP）等[25]。FABPs对长链FA具有高度亲和力，以非共价形式结合。在FA的转运过程中，FABPs可将FA从质膜转运到TG和磷脂合成部位，以及FA氧化部位，从而调控脂质代谢[26-27]。Shi H.等[26]分别在鸡脂肪细胞中干扰和过表达 A-FABP基因后，检测了 24h，36h，48h，60h，72h五个时间点非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid，NEFA）水平和脂质累积水平以及脂质代谢相关基因脂滴包被蛋白 1（perilipin 1，PLIN1），FAS，ACC，LPL，PPARγ，ATGL和E-FABP基因的表达水平。结果表明A-FABP过表达36 h后机体内NEFA水平显著增加，而48 h、60 h和72 h后脂质累积水平显著增加，PPARγ和PLIN1基因的表达上调，而EFABP基因的表达下调。A-FABP干扰60 h后，只有PPARγ显著下调，该结果表明A-FABP基因可能通过PPARγ途径影响脂质代谢，而A-FABP和EFABP基因在鸡的脂肪代谢中存在着代偿作用。多项研究也表明FABP和PPARs基因家族成员间存在着相互调节的作用[28-29]。

1.3 LepR与FSHR

瘦素（leptin，Lep）由白色脂肪细胞分泌，通过与靶组织中的瘦素受体（leptin receptor，LepR）相互作用，在调节食欲，代谢和能量稳态方面发挥着重要作用。Lep可作为体内脂肪含量或能量储备的信号，发送信号给大脑减少食物摄入，并使周围组织减少脂肪摄入，增加能量消耗[30]。研究表明鸡体内注射Lep可降低雏鸡的采食量,加速母鸡的生殖发育[31-32]。此外，Shi Z.等[33]研究表明Lep免疫接种后增加了母鸡的采食量和腹脂沉积。瘦素依赖性信号转导途径已在哺乳动物中得到了证实，为了研究Lep在家禽中的信号级联传递，H.Adachi等[34]对鸡LepR进行了体外表达，发现鼠Lep能与鸡LepR特异性结合，从而加强了细胞中萤光素酶的活化。该研究表明鸡LepR作为一个功能受体，在鸡组织中表达的LepR能够结合内源性配体以及外源哺乳动物的Lep，激活JAK-STAT信号转导通路发挥作用。同样通过其功能受体调控脂质代谢的基因还有促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）基因，Cui H.等[35]研究表明皮下注射FSH后，鸡体内腹脂重增加且促卵泡激素受体（follicle stimulating hormonereceptor，FSHR）基因在腹脂中的表达量也增加。当用FSH刺激前脂肪细胞时，细胞内脂质含量增加，分化进程加快以及FSHR表达量增加。此外，作者检测了FSH处理前后鸡前脂肪细胞中差异表达基因，结果表明FSH通过上调FSHR的表达促进脂质的生物合成，从而介导FA代谢通路，视黄酸代谢通路以及PPAR信号通路中相关基因的表达。

1.4 其他相关基因

在调控前脂肪分化过程中的研究中，在小鼠3T3-L1前脂肪细胞中添加油酸促进了脂质积累，同时影响了CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα）和 PPARγ 启动子的甲基化[36]。Y.Matsubara等[37]利用脂肪酸混合物诱导鸡前体脂肪细胞分化，PPARγ mRNA水平迅速上调，而C/EBPα基因表达量也上调，但晚于PPARγ，表明PPARγ和C/EBPα在脂肪细胞分化过程的重要作用。此外，在鸡前脂肪细胞分化过程中，甾醇调节元件结合蛋白1C（Sterol regulatory element-binding protein 1C，SREBP-1c）和FAS基因的表达量随着分化的进程逐步升高，表明SREBP-1c和FAS也参与了家禽前脂肪细胞的分化过程[38]。脂联素（adiponectin，ADPN）是仅由脂肪细胞分泌的蛋白质激素，Yan J.等[39]研究发现ADPN基因的过表达抑制了脂肪细胞分化和脂肪形成标记基因的表达，同时激活了脂解标记基因的表达，表明ADPN具有抑制鸡前脂肪细胞分化的能力。

此外，运用转录组测序，研究者们也筛选鉴定出大量与鸡脂质代谢相关的候选基因[40-42]。Liu L.等[40]表明硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD），诱导细胞死亡的DFFA样效应因子c（cell death inducing DFFA like effector c，CIDEC），羊毛甾醇合酶（lanosterol synthase，LSS），甲基固醇单加氧酶（methylsterol monooxygenase 1，MSMO1），脂联素、C1Q和胶原结构域（adiponectin，C1Q and collagen domain containing，ADIPOQ），PLIN1，PPARγ，CD36，A-FABP和LPL等基因通过参与类固醇生物合成以及PPAR信号通路调节鸡肌内脂肪代谢。Cui H.等[41]表明选择连接蛋白 4（sorting nexin 4，SNX4）基因表达量与北京油鸡和AA肉鸡中的肌内脂肪含量呈正相关。Li H.等[42]发现溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1（lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1，LPGAT1）基因表达量在产蛋母鸡肝脏中显著低于未开产母鸡，而在哺乳动物中，LPGAT1基因被报道能促进肝脏中TG的生成，表明哺乳动物与禽类LPGAT1基因在调节FA合成中具有不同的表达图谱[43]。

2 参与脂质代谢相关microRNAs

microRNAs（miRNAs）是一类由 19-24 个核苷酸组成的内源性进化保守的非编码小RNA，通过结合到靶基因 mRNA 的 3′端非翻译区（3′UTR），对基因的表达起负调节作用，参与了包括脂肪形成、脂质代谢、细胞增殖、分化、生长、凋亡和发育等生物过程[44-45]。由于家禽脂肪主要都在肝脏合成，Li H等[46]对20周龄和30周龄母鸡的肝脏组织进行了转录组测序，GO分析结果表明差异miRNA的靶基因参与到脂质合成，磷脂代谢以及FA代谢等与脂质代谢相关的生物过程。此外，miR-22-3p可能通过靶向ELOVL脂肪酸延伸酶6（ELOVL fatty acid elongase 6，ELOVL6）和酰基辅酶A合成酶长链家族成员5（acyl-CoA synthetase long-chain family member 5，ACSL5）基因调节脂质沉积。miR-365-3p、miR-218-5p、miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-29a-3p和 miR-23b-3p可靶向脂肪酸去饱和酶1（fatty acid desaturase 1，FADS1）参与长链多不饱和脂肪酸的生物合成过程。此外，大量研究证实miR-33家族参与胆固醇转运与FA代谢过程中的转录调控。miR-33家族包含miR-33a和miR-33b两个成员，分别能被固醇反应元件结合转录因子基因SREBF2和SREBF1激活[47-48]。在哺乳动物中，miR-33的过表达可导致靶向的肉碱棕榈酰转移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）和羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物β（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional multienzyme complex subunit beta，HADHB）基因表达量降低，从而下调细胞脂肪酸β-氧化过程[49]。此外，miR-33通过靶向ATP结合盒亚家族A成员1（ATP binding cassette subfamily A member 1，ABCA1），NPC细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC intracellular cholesterol transporter 1，NPC1）和 ATP结合盒亚家族 G成员 1（ATP binding cassette subfamily G member 1，ABCG1）抑制胆固醇外流和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）的生物合成[50]。为了研究 miR-33在鸡上对脂质代谢的调控机制，Shao F.等[51]在鸡肝细胞系中过表达miR-33后，肉碱O-辛酰转移酶（carnitine O-octanoyltransferase，CROT）与羟酰基辅酶A脱氢酶（hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH）的表达量显著下调。过表达miR-33显著降低了野生型CROT和HADHB的荧光素酶活性，而靶位点突变后，荧光素酶活性下调被清除，该结果表明miR-33可能通过负调控CROT和HADHB基因的表达而在鸡肝脂质代谢中发挥重要作用。

在哺乳动物的研究中，miR-181a、miR-15a/b、miR-196a、miR-17、miR-21 和 miR-143 和 miR-146a-5p被证实促进了前脂肪细胞分化而miR-125a，miR-145，miR-191，miR-199a-5p，miR-375和miR-429能抑制前脂肪细胞的分化[52-61]。在鸡腹脂发育过程的研究中，Wang W.等[62]在腹脂含量具显著差异的两种肉鸡中分离的前脂肪细胞进行了转录组测序，鉴定出33个差异表达的miRNAs，其中富集最多的是let-7家族。Huang H.Y.等[63]对腹脂含量差异显著的鸡的腹脂组织进行了转录组测序，筛选出62个差异表达的miRNAs和303个差异表达的基因，并预测了106个差异表达的基因作为这62个差异表达的miRNA的靶基因，其中11个靶基因参与脂质代谢。作者对筛选出来的差异基因和差异miRNA进行了验证，结果表明miR-19b-3p通过下调ACSL1的表达促进前脂肪细胞的增殖与分化，证实了它在腹脂沉积中的重要作用。

由于肌内脂肪对肉质的重要作用，多项研究揭示了与肌内脂肪相关的miRNAs。在肌内脂肪方面，Chen F.等[64]表明 miR-425-5p通过靶向 Kruppel样因子 13（Kruppel like factor 13，KLF13）进而下调PPARγ来抑制猪肌内脂肪分化。Zhang M.等[65]对肌内脂肪含量存在显著差异的20周龄和55周龄的固始鸡进行了转录组测序，该研究发现差异miRNA对应的靶基因主要集中在泛素介导的蛋白水解、PPAR信号、甘油磷脂代谢、FA代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等途径。此外，作者对筛选出的miR-140-5p进行了验证。在鸡肌内前脂肪细胞转染miR-140-5p过表达载体后，细胞内脂滴数量增加，脂肪分化标记基因PPARG、FABP4水平显著升高，类视黄醇X 受体 gamma（retinoid X receptor gamma，RXRG）基因水平下调。荧光素酶报告基因结果表明，过表达miR-140-5p显著降低了野生型RXRG的荧光素酶活性，而RXRG位点突变导致这种活性下调被清除。结果表明miR-140-5p通过下调RXRG促进脂肪细胞分化。miR-140-5p在哺乳动物中也被证实对脂肪细胞分化的调控作用，并表明通过C/EBPα/miR-140-5p/TGFBR1途径调节脂肪细胞分化[66]。Sun G.等[67]对分化前后的肌内前脂肪细胞以及肌内脂肪细胞进行了转录组测序，结果表明miRNA-18b-3p可通过靶向酰基辅酶A硫酯酶13（acyl-CoA thioesterase 13，ACOT13）基因抑制鸡肌内脂肪细胞分化。此外，miR-223被报道可通过靶向线粒体3-磷酸甘油酰转移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，mitochondrial，GPAM）基因抑制鸡肌内脂肪分化[68]。

3 调控脂质代谢相关通路

大量研究表明PPAR信号通路是参与调节脂质代谢的核心[41，69-70]。Liu L.等[40]对具高低 TG 含量的鸡胸肌肉进行了测序，6个差异表达基因（ADIPOQ，CD36，LPL，SCD，PPARG 和 PLIN1）显著富集于 PPAR信号通路，此外，这些差异表达基因还显著富集于类固醇生物合成，钙信号传导以及细胞连接相关通路（包括焦点粘连，细胞粘连，间隙连接，紧密连接，肌动蛋白细胞骨架调节和ECM-受体相互作用）。这些通路可能是鸡肌内脂肪沉积的关键途径。此外，Cui H.等[41]运用cDNA微阵列技术在不同发育阶段的北京油鸡和AA肉鸡胸肌组织中进行了测序，结果表明PPAR信号通路，MAPK信号通路，ErBb信号通路，细胞连接相关通路（紧密连接，焦点粘连，ECM-受体相互作用，肌动蛋白细胞骨架调节）参与肌内脂肪调节。作者认为与细胞连接相关的过程可能主要通过MAPK活性参与脂质代谢相关途径，从而影响肌内脂肪的沉积。Zhang T.等[70]确定了在不同阶段与前脂肪细胞分化相关的几种途径，例如甘油酯代谢，丙酸酯代谢，FA代谢通路。此外，Wnt信号通路，MAPK信号通路和TGF-β信号通路也与鸡前脂肪细胞的分化显著相关。

为了研究鸡ADPN对脂肪细胞中线粒体发育及功能的影响，Gan L.等[71]用鸡ADPN腺病毒载体处理鸡脂肪细胞，结果表明过表达ADPN可通过激活AMPK/ACC2信号通路促进鸡脂肪细胞中线粒体的生物合成并激活线粒体中脂代谢功能。之前已经提到ADPN具有抑制鸡前脂肪细胞分化的能力，Yan J.等[39]研究了ADPN对与脂肪细胞分化有关的细胞信号通路的影响。结果表明ADPN可促进p38MAPK/ATF-2信号通路，ADPN还可抑制TOR/p70S6激酶信号通路，通过这两个信号途径抑制了CEBPα的表达，从而上调ATGL和下调FAS基因表达，最终抑制前脂肪细胞中的脂质沉积与分化。

由于肌肉发育和肌内脂肪含量在肉鸡产业中的重要作用，达到适当的肌肉和脂肪的比例，是肉鸡业中的一大挑战[72]。为了探究两者的相互作用，研究者构建出卫星细胞与肌内前脂肪细胞的共培养系统，结果表明，肌内前脂肪细胞抑制了卫星细胞的分化并促进了脂肪沉积。转录组结果表明，单培养的卫星细胞和卫星细胞与肌内前脂肪细胞共培养后的差异基因富集在MAPK和PPAR信号通路与细胞连接相关通路（间隙连接，焦点粘连，ECM-受体相互作用，肌动蛋白细胞骨架调节），表明这些通路参与到卫星细胞的脂质沉积中。MAPK信号通路是肌内前脂肪细胞影响卫星细胞的核心通路，可通过介导PPAR信号通路介导卫星细胞中的脂肪沉积[69]。

4 总结与展望

脂肪不仅是机体储存能量的主要来源，也是影响禽类肉品质的主要因素。禽类的脂质代谢是一个复杂的过程，大量相关基因和通路共同调控这一过程。随着生物技术和生物信息学的发展，研究者鉴定出大量与禽类脂质代谢相关的候选基因及miRNAs（见表1）。然而，这些重要候选基因的功能作用，基因之间的互作关系，miRNA对靶基因的调控方式以及调控禽类脂质代谢的具体机制还需要更深入的研究。因此，未来的研究中应集中于进一步确定相关候选基因与禽类脂质代谢之间的功能作用与联系，并揭示相关的分子机制。同时，可利用全基因组、转录组和蛋白质组等多组学联合分析以及三维基因组（Hi-C）等新技术来进一步揭示调控禽类脂质代谢的分子机制。此外，如何在保证不提高腹脂的前提下适当提高肌内脂肪含量是改善肉品质的关键，明确调控腹脂代谢和肌内脂肪代谢的差异基因及机制可能也是未来研究的方向。