过表达miR-140-5p对高脂饲养诱导的非酒精性脂肪性肝病大鼠的作用及机制

卢的一 郭茂东 叶晓华

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种常见的肝病，若不及时加以控制，易随病程进展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌[1]。目前，全球约三分之一人口患有不同程度的NAFLD[2-4]。虽然通过增加运动量、控制饮食及应用法尼醇X受体(FXR)激动剂可在一定程度上抑制NAFLD进展，但仍无法起到保护肝脏的作用[5]。因此，临床上迫切需要一种安全、有效且适用面广的治疗方式用于NAFLD的治疗。已有多项研究表明，Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信号通路参与了NAFLD的发病及进展[6-7]。另有研究指出，miR-140-5p可靶向TLR4/NF-κB信号通路，调节炎性细胞因子水平[8-9]。目前关于miR-140-5p是否可通过调控TLR4/NF-κB信号通路参与NAFLD的发病及进展的报道较少。本研究探讨了过表达miR-140-5p对NAFLD大鼠的作用及其机制与TLR4/NF-κB信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取44只SD大鼠，SPF级，雌雄各半，购自广东省医学动物实验中心[生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002]。44只大鼠均适应性饲养1周，控制昼夜交替频率为12 h，期间给予充足的水和普通饲料饲养。

1.2 造模及分组

从44只SD大鼠中随机选取34只，高脂饲料饲养12周，构建NAFLD大鼠模型[10]。饲养12周末，随机选取4只大鼠处死，采用苏木精-伊红(HE)染色法判断NAFLD大鼠模型是否构建成功。将造模成功的30只大鼠随机分为模型组、空载体组和过表达组，每组10只。空载体组于饲养第13周、第18周尾静脉注射含空载质粒的慢病毒，过表达组于饲养第13周、第18周尾静脉注射含过表达miR-140-5p质粒的慢病毒。剩余10只大鼠为对照组，给予普通饲料饲养。

1.3 HE染色

在饲养第18周末，各组禁食不禁水12 h后，用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，处死大鼠，取其肝脏组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，然后使用RM2016病理组织切片机(购自上海徕卡仪器有限公司)切片。取病理切片，脱蜡，梯度乙醇水化，HE染色(试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司)，观察肝脏组织病理学变化[11]。

1.4 肝功能及血脂相关指标的检测

处死大鼠后，取各组大鼠心脏静脉血5 mL，以3 500 r/min离心15 min，取上层清液。采用酶联免疫吸附法检测血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。上述实验所用试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.5 肝组织中TLR4、NF-κB的检测

采用蛋白质免疫印迹法检测肝组织中TLR4、NF-κB的表达水平[12]。将RIPA裂解液滴加至盛有肝组织的容器中，提取总蛋白，并用BCA蛋白质定量检测试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)进行定量。滴加匀浆缓冲液，4 ℃下以3 500 r/min离心15 min，取上清液；电泳100 min，漂洗3次，转膜；分别滴加兔抗鼠TLR4单克隆抗体、兔抗鼠NF-κB单克隆抗体、β肌动蛋白(购自美国Abcam公司)，4 ℃孵育过夜；滴加二抗(购自美国Abcam公司)，室温孵育2 h；曝光显影，采用ImageJ软件进行分析。

1.6 肝组织中miR-140-5p的检测

采用实时荧光定量PCR法检测肝组织中miR-140-5p的表达水平[13]。应用TRIzol试剂盒提取各组肝组织中的总RNA，然后用反转录试剂盒进行反转录反应，最后用PCR扩增仪扩增cDNA，扩增条件为94 ℃预变性10 min，之后94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40个循环。内参为β肌动蛋白。采用 2-ΔΔCt表示肝组织中miR-140-5p的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组肝组织病理学变化

HE染色结果显示，对照组肝细胞排列正常，肝细胞内无脂肪堆积，无炎性细胞浸润等情况；模型组和空载体组的肝细胞内均有大量脂肪堆积，存在明显的炎性细胞浸润情况，且有肝细胞坏死；过表达组有轻微脂肪堆积和少量炎性细胞浸润，较模型组有明显改善。具体见图1。

图1 各组肝组织病理图像 HE染色 ×400 A 对照组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达组

2.2 各组miR-140-5p的相对表达量比较

对照组、模型组、空载体组和过表达组的肝组织中miR-140-5p的相对表达量分别为1.02±0.05、0.48±0.08、0.50±0.11和2.31±0.10。与对照组比较，模型组肝组织中miR-140-5p的相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组和空载体组比较，过表达组肝组织中miR-140-5p的相对表达量升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 各组肝功能及血脂水平比较

与对照组比较，模型组AST、ALT、TC、TG和LDL-C表达水平均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达组AST、ALT、TC、TG和LDL-C水平均降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 各组AST、ALT、TC、TG和LDL-C表达水平比较()

2.4 各组IL-6、TNF-α的表达水平比较

与对照组比较，模型组IL-6、TNF-α的表达水平均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达组IL-6、TNF-α的表达水平均降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 各组IL-6、TNF-α的表达水平比较()

2.5 各组肝组织中TLR4、NF-κB的相对表达量比较

与对照组比较，模型组肝组织中TLR4、NF-κB的相对表达量均升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达组肝组织中TLR4、NF-κB的相对表达量均降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表4、图2。

表4 各组肝组织中TLR4、NF-κB的相对表达量比较()

图2 各组肝组织中TLR4、NF-κB的蛋白电泳图 A 对照组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达组

3 讨论

NAFLD是一种除外过量饮酒和其他明确的损肝因素所致的，以肝脏脂质变性和脂肪过度贮积为特征的临床综合征[14]。研究显示，全球NAFLD的发病率呈逐年升高趋势，西方国家NAFLD发病率为20%～30%，近年来中国NAFLD发病率明显升高，且有年轻化趋势[15]。目前，有关NAFLD的病因及进展的机制尚未完全阐明，针对NAFLD的治疗尚缺少直接、有效的治疗方案。

微RNA(miRNA)是一种由18～25个核苷酸组成的不具备编码蛋白质功能的RNA，具有调控细胞增殖、迁移、凋亡等多种生物学功能[16]。miR-140-5p作为miRNA中一员，已被报道可通过靶向转化生长因子-β信号转导通路调节脂肪细胞分化[17]，还参与了肝细胞癌、结直肠癌的疾病进展过程[18-19]。本研究主要就miR-140-5p对参与NAFLD发病及进展的TLR4/NF-κB信号转导通路的作用进行初步探究。

本研究通过HE染色法观察各组大鼠肝组织病理学变化，发现过表达组肝细胞内脂质堆积及炎性细胞浸润情况均较模型组和空载体组有明显改善，提示过表达miR-140-5p对NAFLD有保护作用，可改善NAFLD肝组织病变。通过检测各组AST、ALT、TC、TG、LDL-C的表达水平，发现过表达组AST、ALT、TC、TG、LDL-C的表达水平低于模型组，提示过表达miR-140-5p可改善高脂饲养诱导的NAFLD大鼠肝脏功能和脂质代谢紊乱状态。有研究表明，TNF-α在NAFLD患者中高表达，且与其进展为非酒精性脂肪性肝炎密切相关；此外，TNF-α基因多态性与较高的胰岛素抵抗指数关系密切，两者相互作用参与了NAFLD的发病及进展过程[20]。IL-6不仅可促进肝组织再生，同时还可以通过诱导肝细胞凋亡和胰岛素抵抗等刺激肝组织损伤，进而导致NAFLD进展为非酒精性脂肪性肝炎[20]。本研究结果表明，过表达组的IL-6、TNF-α表达水平均低于模型组，提示过表达miR-140-5p可降低高脂饲养诱导的NAFLD大鼠炎性细胞因子水平，进而发挥保护作用。

TLR4是细胞表面识别病原体的受体之一，对革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖尤为敏感。NAFLD患者肠道菌群多处于紊乱状态，进而可产生大量的脂多糖。脂多糖可刺激TLR4表达并与之结合激活NF-κB表达，从而刺激大量炎性细胞因子合成、分泌，诱发肝脏炎性反应，致使肝细胞坏死，肝部损伤[21]。本研究结果显示，过表达组肝组织中TLR4、NF-κB的相对表达量均低于模型组，提示过表达miR-140-5p可能通过抑制TLR4和NF-κB的表达，从而降低炎性细胞因子水平，改善肝脏炎性损伤。

综上所述，过表达miR-140-5p可改善高脂饲养诱导的NAFLD大鼠肝脏功能，纠正其脂质代谢紊乱，减轻炎性反应，其机制可能与调控TLR4和NF-κB的表达水平有关。固醇调节元件结合蛋白-1c信号通路、肠道菌群紊乱及脂联素的信号转导通路等均与NAFLD发病有关，今后本课题组将进一步探究miR-140-5p对上述通路的影响，全面阐释miR-140-5p与NAFLD的关系。