樱桃叶斑病生防菌株萎缩芽孢杆菌菌株QH-588的筛选鉴定

朱杰 程亮 张纲 陈红雨 付丽颖 姚强 郭青云

摘要：【目的】從枸杞根际土壤中分离可拮抗樱桃叶斑病菌的细菌菌株，为樱桃叶斑病防治提供生防资源。【方法】利用稀释平板法从枸杞根际土壤中分离可培养细菌，以平板对峙法测定分离菌株对樱桃叶斑病菌杨柳刺盘孢菌（Colletotrichum salicis）、链格孢菌（Alternaria alternaria）和细极链格孢菌（A. tenuissima）的拮抗效果，结合形态学、生理生化特性和基于16S rDNA、GyrA和GyrB基因序列的系统发育分析对拮抗菌株进行鉴定;通过显微镜观察拮抗菌株对靶标病原菌菌丝形态和孢子萌发的影响，选用樱桃离体叶片培养测定其对樱桃叶斑病的预防和防治效果。【结果】从枸杞根际土壤中共分离获得660株细菌，有10株细菌对供试靶标病原菌具有较强的拮抗效果，其中有4株细菌（QH-588、QH-668、QH-667和QH-664）的发酵液对靶标病原菌的抑制率超过50.00%，经鉴定，菌株QH-588为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus），菌株QH-664、QH-667和QH-668为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）。通过显微观察发现，萎缩芽孢杆菌菌株QH-588可明显抑制靶标病原菌的菌丝生长和孢子萌发;生防效果测定结果表明，菌株QH-588发酵液在樱桃离体叶片上对靶标病原菌具有预防和防治作用。【结论】萎缩芽孢杆菌菌株QH-588具有防治樱桃叶斑病的生防潜力。

关键词： 樱桃;叶斑病;萎缩芽孢杆菌;筛选;鉴定;生物防治

中图分类号： S436.629 ;                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）11-3022-12

Screening and identification of Bacillus atrophaeus QH-588 for biological control of cherry leaf spot

ZHU Jie1， CHENG Liang1，  ZHANG Gang2， CHEN Hong-yu1，  FU Li-ying1，

YAO Qiang1*， GUO Qing-yun1*

（1Academy of Agriculture and Forestry Science in Qinghai University/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management of Qinghai Province/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest of Ministry of

Agriculture and Rural Affairs in Xining， Xining  810016， China; 2Agricultural Technology Extension

Center of Ledu District， Haidong， Qinghai  810700， China）

Abstract：【Objective】Bacterial strains that could antagonize cherry leaf spot were isolated from the rhizosphere soil of Lycium barbarum， so as to provide biocontrol resources for the control of cherry leaf spot. 【Method】The culturable bacteria were isolated from the rhizosphere soil of L. barbarum by dilution plate method. The antagonistic effect of the isolated strains against Colletotrichum salicis， Alternaria alternaria， A. tenuissima was determined by plate confrontation method. Combined with morphological， physiological and biochemical characteristics and phylogenetic analysis based on 16S rDNA， GyrA and GyrB genes sequences，antagonistic bacteriawere identified; the effects of antagonistic bacteria on the mycelial morphology and spores of target fungi were observed under microscope， and the in vitro leaf culture of cherry was selected to determine its prevention and control effect on cherry leaf spot. 【Result】A total of 660 strains of bacteria were isolated from the rhizosphere soil of L. barbarum， of which 10 strains had strong antagonistic effect on the tested pathogens. Among them， the inhibition rate of fermentation broth of 4 strains of bacteria （QH-588， QH-668， QH-667 and QH-664） on the target pathogens exceeded 50.00%. After identification， strain QH-588 was Bacillus atrophaeus， strains QH-664， QH-667 and QH-668 were B. subtilis. Microscopic observation showed that B. atrophaeus strain QH-588 could inhibit the mycelial growth and spore germination of the target pathogen.The results of biological control showed that the fermentation broth of strain QH-588 could prevent and control the target pathogens on the isolated leaves of cherry. 【Conclusion】B. atrophaeus strain QH-588 has the potential of biocontrol against cherry leaf spot.

Key words： cherry; leaf spot; Bacillus atrophaeus; screening; identification; biological control

Foundation item： National Natural Science Foundation of China （31760539）; Key Laboratory Project of Comprehensive Management of Agricultural Pests in Qinghai （2021-ZJ-Y08）

0 引言

【研究意義】枸杞（Lycium barbarum）属茄科植物，是我国珍贵的中药材，可药食两用（杜津昊，2017），还可制酒、制化妆品和作饲料等（姜枚辰等，2020）。同为木本植物的樱桃近年来种植面积不断扩大，就青海省而言，全省的樱桃栽培面积已达800 ha（王海等，2016），但樱桃叶斑病也在逐年加重，据调查，2017—2019年的7—8月，青海省的樱桃叶斑病发病率可高达100%，不仅造成经济损失，还严重威胁樱桃种植业的发展（刘俏等，2020）。樱桃叶斑病可由细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）、链格孢菌（A. alternaria）和杨柳刺盘孢菌（Colletotrichum salicis）引起（刘俏，2020），其中细极链格孢菌还能引起枸杞叶斑病（严林等，2017）。目前，防治由链格孢属和刺盘孢属引起的病害以培育种植抗病品种和使用化学药剂为主（王婧等，2017;王兴红等，2019）。使用化学农药防治植物病害不仅污染环境，还威胁人类健康（张瑞福，2020），而生物防治可有效解决长期使用化学农药带来的病原菌抗性、农药残留以及有害生物再猖獗等问题，还能促进农业绿色发展（张志春等，2020）。因此，利用绿色健康的生物防治手段防治樱桃叶斑病对樱桃种植业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】链格孢属真菌除能引起枸杞叶斑病和樱桃叶斑病外，还可引起苹果树腐烂病（侯宝宏等，2017）、冬枣黑斑病（雷早娟等，2020）、香梨黑斑病（任美佳等，2020）、苹果黑点病（孟祥龙等，2021）和石榴褐斑病（宋晓兵等，2021）等;刺盘孢属真菌可引起核桃炭疽病（王兴红等，2019）、梨树炭疽病（杨小林等，2021）和四季秋海棠炭疽病（张宝清等，2021）等，危害范围极广。目前为止，对细极链格孢菌具有抑制效果的有多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等（李梦娇，2017）;对链格孢菌具有抑制作用的有多粘类芽孢杆菌等（李建嫄等，2013）;对杨柳刺盘孢菌的生防菌筛选尚未见报道。芽孢杆菌属和假单胞菌属等是主要的生防细菌种类（李俊州和文才艺，2015）。芽孢杆菌具有较强的定殖能力，对病原菌有稳定且显著的拮抗作用，能促进植株生长。张翠绵等（2019）筛选出1株枯草芽孢杆菌G81不仅可抑制番茄灰霉菌和辣椒腐霉菌等病原，还能促进番茄幼苗生长。陈爽（2021）通过贝莱斯芽孢杆菌HM3-3对大豆根腐防御酶活性的研究发现，贝莱斯芽孢杆菌不仅对大豆根腐病病原具有拮抗作用，还对大豆具有促生效果。在我国，已利用芽孢杆菌制成多种微生物农药产品并投入植物病害防治，如百抗和依天得等（陈羽娇和余朝阁，2020）。冯时等（2021）在室内筛选出枯草芽孢杆菌（科诺）和复合内生芽孢杆菌（京青）对人参菌核病抑制效果最好。【本研究切入点】土壤不仅是微生物的“天然培养基”，还是最丰富的菌种资源库，而药用植物根际有益微生物种类更是繁多，很容易从药用植物土壤环境中分离、筛选出生防细菌（李俊州和文才艺，2015;刘慧娟等，2019）。目前，对于枸杞根际土壤中是否存在对杨柳刺盘孢菌、链格孢菌和细极链格孢菌均具有抑制效果的生防细菌鲜有报道。【拟解决的关键问题】利用稀释平板法从枸杞根际土壤中分离可培养细菌，以平板对峙法测定分离菌株对樱桃叶斑病菌的拮抗效果，进一步对拮抗菌株进行分类鉴定;通过显微镜观察拮抗菌株对靶标菌菌丝形态和孢子萌发的影响，选用樱桃离体叶片培养测定其对樱桃叶斑病的预防和防治效果，以期从枸杞根际土壤中分离可拮抗樱桃叶斑病菌的细菌菌株，为樱桃叶斑病防治提供生防资源。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试病原菌 细极链格孢菌、链格孢菌和杨柳刺盘孢菌，均为青海省农业有害生物综合治理重点实验室保存菌株。

1. 1. 2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，加水1 L;NA培养基：牛肉浸粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加水1 L;NYD培养基：葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，酵母膏5 g，加水1 L。以上培养基灭菌备用。

1. 2 细菌分离

2019年8月19日在青海省海西蒙古族藏族自治州乌兰县采集枸杞根际土壤，采用稀释平板法对土壤样品中的细菌进行分离纯化。

1. 3 生防菌株活性测定

1. 3. 1 生防菌株发酵液制备 将拮抗菌株接种到NA固体培养基上活化培养24 h，随后用无菌接种环移取1环至灭菌的NA液体培养基中，28 ℃下160 r/min发酵培养48 h，将发酵液在10000 r/min条件下离心5 min去除菌体，上清液用0.22 μm细菌过滤器过滤，得到细菌发酵液备用。

1. 3. 2 生防菌初筛 采用平板对峙法筛选对靶标菌具有拮抗作用的细菌。具体方法：在PDA培养基中央接种靶标菌，在距离靶标菌2～3 cm处点接细菌，以不接细菌的平板为对照，每处理3个重复，25 ℃培养5 d后观察记录细菌菌株对靶标菌的抑制效果。

1. 3. 3 生防菌复筛 对初筛有拮抗效果的细菌菌株进行发酵液和菌体复筛。抑菌圈法：将靶标菌接种在PDA培养基中央，在距离靶标菌3 cm处对称打孔2个（0.5 cm打孔器），每孔加入50 µL拮抗菌发酵液，28 ℃下培养7 d，记录靶标菌直径。对峙法：将靶标菌菌饼接种在PDA固体培养基中央，在距离靶标菌2.5 cm处平行划线接种拮抗细菌，培养7 d后观察并记录拮抗菌对靶标菌的抑制效果。

病原菌生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100

1. 4 优势生防菌株鉴定

1. 4. 1 菌体形态特征观察及生理生化特性测定

生防菌株在NA培养基上28 ℃下培养24 h后，观察其菌落形态特征，同时进行革兰氏染色。参照《伯杰细菌鉴定手册》（布坎南和吉本斯，1984）测定拮抗菌株的淀粉水解和碳源利用等生理生化特性。

1. 4. 2 生防菌分子生物学鉴定 拮抗菌的DNA用生工细菌DNA提取试剂盒提取，用相应的引物进行PCR扩增，16S rDNA、GyrA和GyrB基因序列引物对分别为27F/1492R、P-gyrA-1S/P-gyrA-2SR和UP1-F/UP-2R。PCR反应体系（50 μL）：正、反向引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板1 μL，2×PCR Mix 25 μL，dd H2O 20 μL。反应程序：（1）16S rDNA：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行30个循環;72 ℃延伸10 min。（2）UP1-F+UP-2R：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 80 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。（3）P-gyrA-1S+P-gyrA-2SR：退火温度57 ℃，其他条件与UP1-F+UP-2R引物对的相同。PCR扩增产物送杨凌天润奥科生物科技有限公司测序。将所测得的16S rDNA、GyrA和GyrB基因序列通过NCBI中的BLAST进行相似性比对，利用MEGA 5.0进行DNA多序列同源性分析，采用邻接法（Neighbor-joining method）构建系统发育进化树，确定菌株的分类地位。

1. 5 优势生防菌生长曲线测定

挑取单菌落接种于50 mL NA培养液中，28 ℃下200 r/min振荡培养12 h后获得种子液。采用稀释平板计数法测定种子液浓度，将菌株种子液按2%的接种量扩大培养至250 mL NA培养液中，28 ℃下200 r/min继续振荡培养，每隔2 h取出100 μL菌液检测OD600吸光度，设3个重复。利用Excel 2010绘制生防菌株生长曲线。

1. 6 优势生防菌株对樱桃叶斑病菌的抑菌机理

1. 6. 1 优势生防菌株对樱桃叶斑病病原菌菌丝形态的影响 于25 ℃恒温培养箱内将生防菌株与3株靶标菌进行对峙培养，15 d 后分别挑取抑菌圈边缘菌丝进行显微观察（100倍）（张新杰等，2020）。每处理3个重复。

1. 6. 2 优势生防菌株对樱桃叶斑病病原菌分生孢子形态及萌发的影响 病原菌培养15 d后，加入适量无菌水，用灭菌枪头刮取其分生孢子，用纱布过滤，获取病原菌孢子悬液备用。生防菌28 ℃培养72 h，取灭菌离心管，1∶1等体积加入靶标菌孢子悬液和生防菌发酵液，制备混合液，以只加靶标菌悬液为对照，25 ℃孵育，显微镜下（100倍）观察病原菌分生孢子形态变化情况，并于孵育4、14和24 h记录其萌发数。

孢子萌发率（%）=萌发的孢子数/总的孢子数×100

孢子萌发抑制率（%）=[（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率]×100

1. 7 优势生防菌株在樱桃离体叶片上对3种樱桃叶斑病病原菌的生防效果测定

选用樱桃感病品种萨米脱叶片，消毒洗净备用。参照李军营等（2021）的方法制备病原菌孢子悬浮液（106 CFU/mL）。预防效果测定：先接优势生防菌发酵液20 μL，3 d后接病原菌孢子悬浮液20 μL;防治效果测定：先接病原菌20 μL，待叶片出现病斑后再接生防菌20 μL;分别设清水对照、单独接生防菌对照和单独接病原菌对照。观察测定樱桃叶片上发病情况及病斑大小。

1. 8 统计分析

所得数据用 DPS软件进行方差分析和显著性分析。将处理的数据用Excel 2010、Origin 2019b制作图表。

2 结果与分析

2. 1 初筛结果

从枸杞根际土壤中分离到660株细菌，通过平板对峙法检测每株细菌对3株靶标病原菌（细极链格孢菌、链格孢菌和杨柳刺盘孢菌）的拮抗作用，结果从660株细菌中发现10株（QH-001、QH-468、QH-577、QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、 QH-666、QH-667和QH-668）对杨柳刺盘孢菌有拮抗作用，16株（QH-001、QH-070、QH-348、QH-386、QH-389、QH-390、QH-400、QH-468、QH-577、QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、QH-666、QH-667和QH-668）对链格孢菌有拮抗作用，15株（QH-001、QH-070、 QH-348、 QH-386、QH-390、QH-400、QH-468、QH-577、 QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、QH-666、QH-667和QH-668）对细极链格孢菌有拮抗作用（图1），其中有10株菌（QH-001、QH-468、QH-577、QH-588、QH-634、QH-664、QH-665、QH-666、QH-667和QH-668）对3株靶标病原菌均有拮抗作用。

2. 2 复筛结果

利用3株靶标病原菌对初筛获得的10株拮抗菌进行发酵滤液复筛，从中得到7株抑菌效果显著且稳定的拮抗菌（表1）。对7株拮抗效果较好的菌株中抑制率在50.00%以上的4株拮抗菌进行菌体复筛，发现菌株QH-588对3株靶标病原菌的抑制率最高，达54.45%，其次为菌株QH-668、QH-667和QH-664，表明拮抗菌QH-588、QH-668、QH-667和QH-664菌体及其分泌物均能显著抑制樱桃叶斑病的3种病原。

2. 3 生防菌株鉴定结果

2. 3. 1 生防菌株形态特征与生理生化特性 菌株QH-588菌落在NA固体培养基上前期呈乳白色，后期呈乳黄色逐渐产生黑色素，菌落不透明，边缘不规则，呈波状，菌落表面不平滑，微微凸起，革兰氏染色为紫色，表明其为革兰氏阳性菌（图2-A）。菌株QH-664、QH-667和QH-668在NA培养基上菌落均呈乳白色，微黄，不透明，边缘不整齐，有黏性，革兰氏染色均为阳性（图2-B、图2-C和图2-D），杆状细菌。经形态学初步鉴定菌株QH-588、QH-664、QH-667和QH-668为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。4株生防菌的生理生化特性见表3，4株生防细菌均能利用葡萄糖、蔗糖和果糖，V-P测定均为阳性，好氧，能使淀粉水解，明胶液化等。

2. 3. 2 生防菌株分子生物学鉴定 将菌株QH-588、QH-664、QH-667和QH-668的16S rDNA、GyrA和GyrB基因测序结果提交到GenBank，获取登录号。在NCBI数据库中对其基因序列进行BLASTn比对，比对后获得4株拮抗菌的确定属。将拮抗菌的3条基因序列按照16S rDNA、GyrA和GyrB的顺序合并构建系统发育进化树，结果显示，菌株QH-588以100%与B. atrophaeus聚为同一支，菌株QH-664、QH-667和QH-668以100%与B. subtilis聚为同一支，结合4株生防菌株的形态和生理生化特征，将菌株QH-588鉴定为萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus），菌株QH-664、QH-667和QH-668为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）（图3）。

2. 4 菌株QH-588生长曲线

选取拮抗效果最好的菌株QH-588进行后续研究。由图4可看出，菌株QH-588在摇床振荡培养0～4 h为延迟期、10～20 h为菌体对数生长期、36～50 h为稳定期，52 h后菌体生长进入衰亡期，因此取12 h的对数生长期发酵滤液作为种子液进行发酵试验。种子液浓度采用稀释平板计数法测得1.95×108 CFU/mL。

2. 5 菌株QH-588对3株靶标病原菌的抑菌机制

2. 5. 1 菌株QH-588对病原菌菌丝形态的影响 试验结果显示，菌株QH-588发酵液使杨柳刺盘孢菌的菌丝弯曲，节间缩短，部分还出现凹凸现象（图5-A1和图5-B1）;使链格孢菌菌丝细胞壁加厚，节间缩短，膨大，呈串珠状排列（图5-A2和图5-B2）;使细极链格孢菌部分菌丝细胞异常膨大，部分呈串珠状排列（图5-A3和图5-B3）。

2. 5. 2 菌株QH-588对病原菌分生孢子形态及萌发的影响 试验结果显示，菌株QH-588发酵液对杨柳刺盘孢菌、细极链格孢菌和链格孢菌的分生孢子形态无明显影响。病原菌分生孢子悬浮液与菌株QH-588发酵液共同孵育14 h时，菌株QH-588发酵液对杨柳刺盘孢菌孢子的萌发抑制率达最大值，为67.07%;孵育24 h时，菌株QH-588發酵液对链格孢菌和细极链格孢菌孢子的萌发抑制率达最大值，分别为41.08%和60.81%（图6）。

2. 6 菌株QH-588在离体樱桃叶片上对3株靶标病原菌的生防效果

2. 6. 1 预防效果 采用针刺接种法在樱桃叶片上接种菌株QH-588，3 d后接种相应病原菌，测定菌株QH-588对樱桃叶斑病的预防效果，结果发现，用菌株QH-588和靶标病原菌处理后，在樱桃叶片上均可明显观察到病斑变成深褐色，无轮纹（图7-A、图7-B和图7-C）;而仅接种病原菌的叶片病斑颜色正常，轮纹清晰（图7-D、图7-E和图7-F）。接种杨柳刺盘孢菌3 d后，菌株QH-588对其抑制率达最大值，为17.21%（图9-A）;接种链格孢菌5 d后，菌株QH-588对其抑制率达大值，为44.96%（图9-B）;接种细极链格孢菌3 d后，菌株QH-588对其抑制率达最大值，为14.14%（图9-C）。表明菌株QH-588对樱桃叶斑病有预防作用。

2. 6. 2 防治效果 待接种靶标病原菌的樱桃叶片出现病斑后，针刺接种菌株QH-588，测定菌株QH-588对樱桃叶斑病的防治效果，结果（图8）发现，接种菌株QH-588后第5 d，樱桃叶片上的病斑变为深褐色，轮纹较浅;而仅接种病原菌的叶片病斑颜色棕黄，轮纹清晰;第6 d时，菌株QH-588对杨柳刺盘孢菌、链格孢菌和细极链格孢菌的抑制率达最大值，分别为6.47%、47.08%和36.06%（图9）。表明菌株QH-588对樱桃叶斑病具有防治作用。

3 讨论

本研究从枸杞根际土壤中分离获得660株细菌菌株，并从中筛选获得4株（QH-588、QH-664、QH-667和QH-668）对樱桃叶斑病病原菌杨柳刺盘孢菌、链格孢菌和细极链格孢菌的抑制率均超过50.00%的拮抗菌株，经鉴定，菌株QH-588为萎缩芽孢杆菌，菌株QH-664、QH-667和QH-668为枯草芽孢杆菌。目前，用于防治农业植物病害的生防菌最多的是芽孢杆菌属。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中最常见的一种，是一类好氧、产芽孢、无荚膜、能运动的革兰氏阳性杆状菌，其具有较强的耐盐性和抗逆性，无耐药性，且不具备致病性（巴翠玉等，2017;杜汉宇等，2020）。萎缩芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的黑色变种（杨雪等，2020），分布于土壤、深海海泥、藻类植物及农作物中（刘思靖，2019）。迄今国内外对萎缩芽孢杆菌的研究已涉及多个领域，因其无致病性，具有较强的低温适生性和耐盐性（薛鹏琦等，2011;孙崇思等，2014），具有一定的降解纤维素活性，可应用于饲料加工及低温地区秸秆还田;因萎缩芽孢杆菌对病原菌具有较强的拮抗作用，近年来成为植物病害生物防治的研究热点（孙崇思等，2014）。目前已报道萎缩芽孢杆菌可抑制的病害有23种左右，如生姜根腐病（Veerubommu et al.，2013）、黄瓜白粉病（Zhang et al.，2013）、杨树炭疽病（黄华毅等，2017）、草莓枯萎病（刘邮洲等，2017）、墨兰炭疽病（祖丽皮亚木·木沙尔等，2018）、刺果番荔枝炭疽病和鳄梨炭疽病（Guardado-Valdivia et al.，2018）、黄芪根腐病（高芬等，2019）、瓜果早疫病和腐霉病（刘思靖，2019）、苹果树腐烂病（马荣等，2020），以及茄子黄萎病、番茄立枯病、番茄疮痂病、辣椒疫霉和棉花立枯病等（李春等，2015）。尚未见其对樱桃叶斑病防治作用的报道。

本研究发现，菌株QH-588发酵液使供试樱桃叶斑病病原菌细极链格孢菌、链格孢菌和杨柳刺盘孢菌菌丝细胞节间缩短、弯曲、膨大，并且抑制分生孢子萌发，与黄华毅等（2017）研究发现萎缩芽孢杆菌XW2可使杨树炭疽病菌菌丝发生萎缩、局部膨大等畸形，且明显抑制分生孢子萌发的结果一致，推测菌株QH-588通过分泌次级代谢产物对樱桃叶斑病病原进行抑制。萎缩芽孢杆菌产生的次生代谢产物途径有3类：核糖体合成途径、非核糖体合成途径及其他，而这些次级代谢产物中具有一定抗菌活性的有核糖体途径中合成的黑色素和活性蛋白，非核糖体途径中合成的脂肽类物质（Veerubommu et al.，2013）。刘邮洲等（2017）发现萎缩芽孢杆菌YL3发酵液中脂肽类粗提物对草莓枯萎病菌菌丝生长有抑制作用，且检测到菌株YL3脂肽类粗提物中含有表面活性素和泛革素。陈欣欣（2015）研究发现，萎缩芽孢杆菌SF1中具有抑制尖孢镰刀菌胡麻专化型的抗菌活性蛋白质。对于本研究中萎缩芽孢杆菌菌株QH-588对樱桃叶斑病病原具有抑制作用的次级代谢产物合成途径还需进一步探究。

生防菌生防效果的稳定性是目前的研究热点之一（王博，2020）。本研究中，菌株QH-588在离体樱桃叶片上对叶斑病的防治效果远没有在培养皿上的好，可能的原因有：一是生物防治中最关键的步骤是定殖，而萎缩芽孢杆菌菌株QH-588未能很好地在叶片上定殖，因而未能完全发挥其预防作用;二是在接种拮抗菌QH-588前大部分病斑直径已达2～3 mm，病原菌基数已到达一定的量，导致防治效果降低，后续将针对提高该生防菌在实际应用上的防效进行探索。另外，本研究发现单接拮抗菌QH-588时，叶片与接种无菌水效果无差别，可見萎缩芽孢杆菌菌株QH-588对樱桃叶片无毒害作用，表明菌株QH-588可应用于生产中防治樱桃叶斑病。

4 结论

从枸杞根际土壤中分离获得的萎缩芽孢杆菌菌株QH-588不仅在培养基上对细极链格孢菌、链格孢菌和杨柳刺盘孢菌具有稳定且显著的拮抗作用，在樱桃离体叶片上也展示出一定的预防和防治效果，具有防治樱桃叶斑病的生防潜力。

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收稿日期：2021-06-23

基金項目：国家自然科学基金项目（31760539）;青海省农业有害生物综合治理重点实验室项目（2021-ZJ-Y08）

通讯作者：姚强（1978-），https：//orcid.org/0000-0001-8873-1737，博士，副研究员，主要从事植物病害研究工作，E-mail：yaoqiang 2010@126.com;郭青云（1965-），https：//orcid.org/0000-0002-0829-7641，研究员，主要从事生物防治研究工作，E-mail：guoqingyunqh@163.com

第一作者：朱杰（1997-），https：//orcid.org/0000-0002-7164-2145，研究方向为植物病害生物防治，E-mail：863238253@qq.com