贝莱斯芽孢杆菌抑尖孢镰刀菌脂肽类物质的鉴定

郭 蔓，张朝正，赵 华*

（天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457）

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是在全世界范围内广泛传播的、能引起多种植株萎蔫枯死的一种土传性病害病原菌[1]，对番茄（Lycopersicon esculentum）、葫芦科（Cucurbitaceae）植物、棉花（Gossypiumspp.）和香蕉（Musa nana）等高经济价值作物具有很大的危害[2]。尖孢镰刀菌在防控方面非常的困难，主要是因为尖孢镰刀菌除了能够在宿主植物中存活外，还能在土壤及空气中存活10年以上，仍表现出很强的致病性[3]。该病原菌最先由LINK发现并命名[4]，其形态差异较大，迄今为止已有多种尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）被分离并鉴定，根据侵染的农作物的不同，将尖孢镰刀菌分为不同的专化型，而又根据其致病能力的差异在不同专化型下可分为不同的生理小种[5]。

植物病毒害有多种防治方法[6]，其中，生物防治是一种环保无污染的方式。生物防治是利用微生物之间，以及微生物与植物之间的相互作用实现有益微生物对有害微生物的抑制作用[7]。许多微生物通过产生拮抗物质抑制尖孢镰刀菌的生长，是一种经济有效的方法，不仅不会对环境造成二次污染，还能够从源头控制其生长[8]。对于尖孢镰刀菌引起的枯萎病进行生物防治的微生物有真菌、细菌、放线菌[9-10]。芽孢杆菌属（Bacillussp.）是一类重要的生防细菌，其多个种类具有较好的生物防治功能[11]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛存在于自然界中，因其具有拮抗范围广、效果明显，繁殖快，无害无污染等优点而被广泛应用为生防细菌[12]。研究发现芽孢杆菌对多种真菌性病原体都具有很好拮抗效果，其分泌的纤维素酶和蛋白酶等拮抗物质抑制病原菌的生长，由于抑菌物质分泌在胞外，拮抗效果更加明显[13]。

芽孢杆菌在生长与繁殖过程中会产生许多具有抑菌活性的代谢产物[14]，如细菌素[15]、伊枯草菌素、表面活性素、二磷酸硫胺素、几丁质酶、纤维素酶[16]、碱性蛋白酶、β-甘露聚糖酶和氨肽酶等[17]。有研究表明，从土壤中分离出来的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）对番茄灰斑病菌具有抑制作用，抑菌圈直径可达15.5 mm，其无菌发酵液对灰斑病菌丝的生长有强烈的抑制作用[18]；贝莱斯芽孢杆菌B18对香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种的生物防治有较好的效果，防治效果高达67.9%[19]。前期已从实验室分离筛选获得1株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）P9，其代谢产物对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）生长具有较强的抑制作用[20-21]。前期的实验已经确定产生的抑菌物质主要为脂肽类抗生素。因此，本研究对贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）发酵液中的抑菌物质进行分离纯化和鉴定，将其与已报道的抑菌活性代谢产物进行比较，以期获得新物质，为利用生防制剂控制尖孢镰刀菌提供理论依据，为微生物生防农药的化学合成提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）P9：天津科技大学工业发酵微生物重点实验室筛选获得；尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）：天津科技大学菌种保藏中心，编号TCCC40009。

1.1.2 培养基

LB培养基[22]：酵母浸物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化钠10.0 g/L，pH7.2～7.4，固体培养基时另添加琼脂18.0 g/L，121 ℃灭菌20 min。

马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基[23]：马铃薯浸出液200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然。固体培养基时另添加琼脂18 g/L，115 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂

酵母浸粉（生化试剂）：天津一方科技有限公司；蛋白胨（生化试剂）：上海易势化工有限公司；氯化钠、甲醇（分析纯）：天津艾利安电子科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；浓盐酸（分析纯）：天津市北方医化学试剂厂；乙腈（色谱级）：天津康科德科技有限公司；甲酸（色谱级）：天津益仁达化工有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

H1815高速离心机：湘仪离心仪器有限公司；HPX-9162 MBE电热恒温恒湿培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SY.45-NJB牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm）：北京先驱威锋技术开发公司；G6545B高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用（high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）仪、1200高效液相色谱仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肽类抗菌物质的提取

酸沉淀法提取：将3 mL贝莱斯芽孢杆菌P9接种于100 mL LB培养基中，于30 ℃、170 r/min条件下培养48 h，收集50 mL发酵液至离心管中，8 000 r/min离心20 min。取上清液，用1 mol/L的盐酸调节pH至2.0，4 ℃静置12 h。收集溶液，8 000 r/min离心20 min，弃上清液。所得沉淀加入5 mL甲醇，用NaOH调节pH至7.0，室温抽提8 h，抽提过程中可以放在超声仪中加速溶解，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，抽提过程重复3次，收集所有抽提液，利用旋转蒸发仪进行浓缩。浓缩液用0.22 μm的滤膜进行抽滤，即得到抗菌脂肽粗提物。

有机溶剂沉淀法提取：取50 mL无水乙醇缓慢添加到50 mL发酵液中，边加边搅拌，然后在4 ℃条件下静置过夜，4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min，分别收集上清液和沉淀。将上清液经旋转蒸发仪浓缩至5 mL，沉淀用5 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）溶解，经0.22 μm的生物滤膜过滤除菌体，即得到抗菌脂肽粗提物。

1.3.2 体外抑菌活性的测定

尖孢镰刀菌孢子液制备：将尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）划线接种于PDA培养基，30 ℃条件下静置培养5 d，使用灭菌打孔器在菌落边缘区域取直径为5 mm的菌饼，放置于PDA平板中央，30 ℃恒温培养4～5 d，取无菌生理盐水水洗，所得的水洗液经灭菌的4层无菌滤布过滤即得真菌孢子液，将所得的真菌孢子液稀释至OD600nm值为0.9，4 ℃条件下保存备用。

抑菌活性的测定：取100μL尖孢镰刀菌孢子液均匀涂布于PDA平板上，在距平板中心25 mm处放置牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm），每个牛津杯中加入利用不同提取方法提取的抗菌脂肽提取液100 μL，置于30 ℃恒温培养箱培养4 d，采用牛津杯法测量抑菌圈直径[24]。

1.3.3 脂肽类物质的高效液相色谱分析

将提取的脂肽类物质粗提物进行高效液相色谱分析，色谱条件：Eclipse XDB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），进样量20 μL，流动相为乙腈∶水=40∶60（V/V），流速1 mL/min，检测波长210 nm，分析时间14 min。通过色谱图分析该脂肽类物质粗提物的种类。

1.3.4 脂肽类抗生素的分离制备

制备柱为EclipseXDB-C18色谱柱（5μm，9.4mm×250mm），进样量1 mL，流动相为乙腈∶水=40∶60（V/V），流速5 mL/min，检测波长210 nm，按峰阈值收集样品。将收集到的各峰样品在65 ℃条件下旋转蒸发浓缩，进行冷冻干燥，可得到固体脂肽类物质[25]。采用牛津杯法测定体外抑菌活性，将有抑菌活性的物质进行质谱分析。

1.3.5 脂肽类物质高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析

将1.3.4中多功能液相分离制备出来的有抑菌活性的组分进行高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析。液相色谱条件为：ZOBAX C18色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），进样量5 μL，柱温30 ℃，检测波长210 nm，流速0.5 mL/min，检测时间15 min。流动相A：0.1%甲酸的水，流动相B：100%乙腈，A∶B=60∶40（V/V）。质谱条件：毛细管电压160 V，喷雾电压1 kV，干燥气温度320 ℃，正离子模式检测，检测范围为150～1 000 amu。利用电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI）-质谱测定脂肽类化合物的相对分子质量，并对一级质谱的主要离子峰进行分析。

2 结果与分析

2.1 脂肽类抗生素粗提物体外抑菌活性的测定

脂肽类抗生素粗提物对尖孢镰刀菌的抑制作用见图1。由图1可知，通过酸沉淀法和有机溶剂沉淀法从贝莱斯芽孢杆菌P9发酵液中提取出来的脂肽类抗生素粗提物对于尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）都有明显的体外抑菌活性，抑菌圈直径分别为（13.5±0.05）mm，（8.5±0.08）mm，其中，酸沉淀法的抑菌效果优于有机溶剂沉淀法。因此，对酸沉淀法提取出来的脂肽类抗生素粗提物进行进一步研究。

图1 脂肽类抗生素粗提物对尖孢镰刀菌的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of crude extract of lipopeptide antibiotics on Fusarium oxysporum

2.2 脂肽类抗生素粗提物的高效液相色谱分析

采用高效液相色谱分析酸沉淀法得到的脂肽类抗生素粗提物，结果见图2。由图2可知，该脂肽类抗生素粗提物分别在3.1 min、6.6 min、7.1 min、7.6 min、8.1 min、9.2 min、11.1 min出现7个主要的离子峰，推测该脂肽类抗生素粗提物主要有7种组分，编号为1#～7#。

图2 脂肽类抗生素粗提物的高效液相色谱分析结果Fig. 2 Analysis results of crude extract of lipopeptide antibiotics by HPLC

2.3 脂肽类抗生素物质的分离制备

通过多功能制备液相仪对这7种组分进行分离，并利用牛津杯法测定各组分的抑菌性能，结果见表1。由表1可知，7种组分中有4种组分有明显的抑制尖孢镰刀菌生长的作用，分别为组分2#、4#、6#、7#，其对尖孢镰刀菌的抑菌圈直径分别为（13.3±0.01）mm、（13.5±0.04）mm、（14.5±0.02）mm、（13.2±0.01）mm。

表1 7种组分对尖孢镰刀菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 7 components on Fusarium oxysporum

2.4 脂肽类抗生素物质的高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析

采用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪对4种组分（2#、4#、6#、7#）的一级质谱的主要离子峰进行分析，结果见图3～图6。

图3 组分2#的高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析结果Fig. 3 Analysis results of component 2#by HPLC-Q-TOF-MS

图4 组分4#的高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析结果Fig. 4 Analysis results of component 4#by HPLC-Q-TOF-MS

图5 组分6#的高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析结果Fig. 5 Analysis results of component 6#by HPLC-Q-TOF-MS

图6 组分7#的高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析结果Fig. 6 Analysis results of component 7#by HPLC-Q-TOF-MS

由图3可知，组分2#的质谱图中，在质核比1 036.691 9、1 058.672 9、1 074.567 9处有准碎片离子峰，与研究报道中[26]的芽孢杆菌产生的脂肽化合物的精确质荷比值[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+的数据吻合，可以得出组分2#中可能含有C15SurfactinA或C16SurfactinB或C15Surfactin C。这三种物质的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+完全相同，为同分异构体。SurfactinA、SurfactinB、SurfactinC的结构式如下：

由图4可知，组分4#的质谱图中，在质核比1 045.557 8、1 067.539 1、1 083.507 3处有准碎片离子峰，与鲁小城[26]研究中C15BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+质荷比相符合，所以确定组分4#为C15BacillomycinD。BacillomycinD的结构式如下：

由图5可知，组分6#的质谱图中，在质核比1 031.542 1、1 053.522 9、1 069.492 5处有准碎片离子峰，与文献[26]中C14BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+质荷比相符合，从而确定组分6#为C14BacillomycinD。

由图6可知，组分7#的质谱图中，在质核比1 059.572 9、10 81.553 4、1 097.545 1处有准碎片离子峰，与文献[26]中C16BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+质荷比相符合，确定组分7#为C16BacillomycinD。

3 结论

本研究选用贝莱斯芽孢杆菌P9为研究对象，通过酸沉淀法和有机溶剂沉淀法从其发酵液中提取脂肽类抗生素粗提物。通过牛津杯抑菌实验发现，该脂肽类抗生素粗提物对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）有较好的抑菌活性，且酸沉淀法提取的粗提物抑菌活性较高。通过多功能制备液相仪从粗提物中共分离出7种成分，其中4种成分有抑菌活性。通过高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪分析对这4种成分进行鉴定，确定菌株P9发酵液中具有抗菌活性的脂肽类物质为C14-16BacillomycinD的同系物及C15SurfactinA或C15Surfactin C或C16SurfactinB。本研究阐明了贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）P9抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）生长的主要活性成分，为利用生防制剂控制尖孢镰刀菌生长提供理论依据。