双歧杆菌在婴儿配方奶粉中的稳定性研究

文/萧婷婷 吴 颖 陈方圆 刘 内

（湖南欧比佳营养食品有限公司）

双歧杆菌是从婴儿粪便中分离出来的一种革兰氏阳性专性厌氧菌，是人体重要的益生菌，可以有效调节婴幼儿肠道微生态，具有改善喂养不耐受，增强婴幼儿机体免疫力的功能，能有效预防和治疗腹泻并缓解过敏症状[1～5]。

婴儿配方奶粉中双歧杆菌活菌存活率受温度、水分活度等因素影响，活菌数会随着储存时间的增长而下降[6～8]，从而影响产品货架期。《GB 10765—2010食品安全国家标准 婴儿配方食品》规定添加益生菌的婴幼儿配方食品在货架期内活菌数要≥1.0×106CFU/g[9]。现市售奶粉货架期大多为两年，目前对于双歧杆菌在奶粉中的稳定性研究试验周期均较短[6～8，10]，对于双歧杆菌奶粉产品货架期内产品稳定性还需要进一步的研究。本文将添加定量动物双歧杆菌Bb-12的婴儿配方奶粉放置在不同的存储环境中进行6 个月的加速试验和24 个月的长期试验，通过测定水分含量、水分活度和活菌数，研究货架期内活菌数的稳定性情况，为添加双歧杆菌的产品货架期的确认提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料

菌种：动物双歧杆菌Bb-12购自丹麦科·汉森有限公司，活菌数≥3.0×1010CFU/g。

婴儿配方奶粉：800 g充氮罐装（残氧量≤3%），其中动物双歧杆菌Bb-12添加量为500 mg/kg。

培养基：MRS培养基。

1.2 主要仪器设备

恒温恒湿箱、电子天平、厌氧培养箱、无菌超净工作台、水分活度测定仪、电热恒温干燥箱。

1.3 检测方法

1.3.1 活菌数的测定

取25 g奶粉到225 mL无菌稀释液混匀，制成1：10的样品匀液。取1 mL之前配制的1：10样品匀液到9 mL无菌稀释液中，混匀成1：100的样品匀液，如此制备10 倍系列稀释样品匀液。选择2～3 个连续稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于两个灭菌平皿内，同时做稀释液的空白对照，然后及时将46℃的培养基倾注平皿混匀。凝固后于（36±1）℃培养箱厌氧培养48～72 h。培养后计数平板上的所有菌落数。

1.3.2 水分活度的测定

称取约1 g（精确至0.01 g）试样，迅速放入样品皿中，封闭测量仓，在20～25 ℃，相对湿度50%～80%的条件下测定，每隔5 min记录水分活度仪的响应值。当相邻两次响应值之差小于0.005 Aw时，即为测定值，仪器充分平衡后，同一样品重复测定3 次。当符合精密度所规定的要求时，取两次平行测定的算术平均值作为结果。

表1 长期试验和加速试验过程中水分含量的变化

1.3.3 水分含量的测定

取洁净的称量瓶， 置于101～105 ℃的干燥箱中，平盖斜支于瓶边，加热1 h，取出盖好，置于干燥器内冷却0.5 h，称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2 mg，恒重。称取3 g奶粉（精确至0.0001 g），放入此称量瓶中，试样厚度不超过5 mm，如为疏松试样，厚度不超过1 0 mm，再将称量瓶放入101～105℃干燥相中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4 h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5 h后称量。然后再放入101～105 ℃干燥箱中干燥1 h作用，取出，放入干燥器内冷却0.5 h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2 mg，恒重。

1.4 试验原理及方法

1.4.1 长期试验方法

将添加动物双歧杆菌Bb-12的真空充氮包装（残氧≤3%）的8 0 0 g 听罐试验样品放置常温常湿实验室。在放置0 个，3个，6 个，9 个，12 个，18 个和24 个月后，取样检测分析样品的水分含量、水分活度和双歧杆菌活菌数。

1.4.2 加速试验原理及方法

加速试验中，为避免温度过高加快奶粉中蛋白质变性、脂肪氧化、美拉德反应等，实验温度选取（40±2） ℃。根据Arrhenius经验公式，即K[T+10℃]/K[T]=2（式中K为反应速度常数），反应温度每升高10 ℃，化学速率升高1 倍，且反应速度常数与食品货架寿命成反比，即反应速度常数越大，货架寿命越短。则（40±2） ℃加速6 个月相当于（20±2） ℃条件下存放24个月。

取添加动物双歧杆菌Bb-12的真空充氮包装（残氧≤3%）的800 g听罐试验样品放置在恒温恒湿箱中，设置实验条件为：温度（40±2） ℃，湿度（75±5）%RH。在放置0 个，1 个，2 个，3个，6 个月后，取样检测分析样品的水分含量、水分活度和双歧杆菌活菌数。

2 结果与讨论

2.1 长期试验和加速试验过程中水分含量的变化

水分含量是奶粉重要的质量指标之一，国家标准要求婴配粉中水分含量必须控制在5%以下。当奶粉中水分含量过高时，易造成奶粉结块，引发微生物滋长， 导致产品变质。由表1 数据分析，水分含量在长期试验和加速试验过程中整体变化幅度不大， 含量分别为（2.5 6±0.1 3）%、（2.44±0.06）%，所有检测数据均符合GB 10765要求。在加速试验的高湿（75±5）% RH环境下，水分含量与长期试验无较大差异，侧面说明该产品选用的马口铁罐包装材料阻隔性很好，外界环境未能对罐内奶粉产生影响，能更好地保证产品质量。

表2 长期试验和加速试验过程中水分活度的变化

表3 长期试验和加速试验储存过程中活菌数的变化

2.2 长期试验和加速试验过程中水分活度的变化

水分活度是影响益生菌稳定性的主要因素。水分活度越高，益生菌稳定性越差，当水分活度控制在0.20 Aw以下时，活菌数衰减率最低[6，7]。由表2结果可知，在储存过程中水分活度随储存时间的延长基本稳定。长期24 个月试验和加速6 个月试验水分活度检测值的变异系数分别为0.56%和0.49%，说明试验期间水分活度相对稳定。但试验中产品的水分活度最小为0.322，较益生菌奶粉理想水分活度（0.2以下）[10]略高，这可能会对产品中的动物双岐杆菌活菌数稳定性造成一定的影响。

2.3 长期试验和加速试验储存过程中活菌数的变化

益生菌产生效果的重要保证是益生菌的活菌数量。当益生菌的活菌数大于1.0×106CFU/g时，即可满足婴幼儿从产品中摄入的双歧杆菌活菌有效剂量。由表3数据可知，双歧杆菌活菌数在长期试验和加速试验下有不同程度的衰减。加速试验期间，从原来的2.14×107CFU/g下降到了1.42×107CFU/g，双歧杆菌活菌数衰减了33.64%，活菌数数量级没有变化。在长期试验中，存放12个月后双歧杆菌活菌数衰减了40.52%，即由2.32×107CFU/g下降至1.38×107CFU/g；试验结束时双歧杆菌活菌数较最初衰减了53.02%，下降趋势较明显，但活菌数数量级依旧没有改变，为1.09×107CFU/g。长期试验的最终结果与齐晓彦[6]等的研究发现（当水分活度大于0.25时活菌数存活率为50%）接近。由试验数据说明，双歧杆菌活菌数经过长期24 个月和加速6 个月的试验后，均有一定程度的衰减，但是活菌数量级保持不变，整体稳定性良好，其活菌数仍远大于1.0×106CFU/g，符合GB 10765要求。

3 结论

动物双歧杆菌Bb-12添加量为500 mg/kg的婴儿配方奶粉经干法混合，充氮罐装（残氧量≤3%）成800 g听装成品后，在加速试验（40±2）℃，（75±5）%RH条件下放置6个月，双歧杆菌活菌数检测结果由2.14×107CFU/g下降至1.42×107CFU/g，活菌数数量级没有降低，衰减率为33.64%。长期试验（常温、常湿）条件下放置24 个月，双歧杆菌活菌数检测结果由2.32×107CFU/g下降至1.09×107CFU/g，衰减率为53.02%，活菌数数量级没有变化，整体稳定性良好，符合国家标准要求。试验证明，动物双歧杆菌Bb-12在婴儿配方奶粉保质期（2年）内质量稳定。