七厘散含药血清对大鼠骨膜间质干细胞Wnt/β-catenin信号通路表达的影响

宋寒冰，刘家兴，王革强，张大鹏，姜益常，任树军，王 飞

（黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040）

骨质疏松症（OP）是一种代谢性骨病，其特征是骨量减少和微观结构恶化，最终引起脆性骨折效应的风险增加[1]。流行病学表明，OP和骨折已经导致经济成本逐渐增加[2]。病理研究[3]发现Wnt/β-catenin信号通路在骨头形成中具有有益作用，已被确定为骨质疏松症治疗的潜在靶标。目前关于七厘散促进骨折愈合的确切分子机制的报道较少，但是可以确定的是Wnt/β-catenin信号通路与骨细胞的生长、分化、凋亡密切相关，其是调控细胞形状、功能、增殖、分化的关键信号通路之一[4]，并且Wnt/β-catenin信号通路参与骨骼生长和重塑[5]，但七厘散胶囊能否激活Wnt/β-catenin尚不清楚。研究[6]发现辛伐他汀和七厘散都能促进成骨细胞的增殖，提高愈伤组织质量。研究[7]使用七厘散片对MC3T3-E1细胞进行增殖和矿化,发现七厘散可以在加入培养后的24h和48h增强ALP活性和钙结节。本研究首先制备了七厘散含药血清，并进一步研究其对骨膜间质干细胞（BMSC）的增殖和成骨分化以及与Wnt/β-catenin信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

七厘散由黑龙江中医药大学第一附属医院药学系提供。胎牛血清（FBS），α-最低必需培养基（α-MEM）以及青霉素和链霉素购于碧云天（中国北京）。成骨诱导培养基（OIM）购自Sciencell公司（美国）。ICG001（抑制剂）购自碧云天（中国北京）。ELISA检测试剂盒购自武汉博士特公司（中国武汉）。化学发光检测试剂盒购自索莱宝（中国北京），抗体β-catenin、Wnt7、Wnt4a、Osteocalcin、Runx2、β-actin购自Abcam（美国加利福尼亚州）。

1.2 动物

SD大鼠10只，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为SCXX（京）2011-0011。饲养于黑龙江中医药大学（中国黑龙江）。饲养方法：昼夜明暗交替时间为12h/12h，温度18～26℃，相对湿度40%～70%，自由饮水进食。实验组组SD大鼠0.5g·kg-1七厘散灌服，灌胃6h制得含药血清，空白对照组灌服等剂量的生理盐水。本实验经黑龙江中医药大学第一附属医院动物伦理委员会批准。

1.3 细胞培养

在给大鼠灌胃七厘散6h后，获得七厘散含药血清。使用密度梯度离心法从5只大鼠中获得骨髓基质细胞（BMSC）。取幼龄SD大鼠骨膜，Ⅱ型胶原酶消化后收集消化液并离心，培养液为含以10% FBS的成骨诱导培养基（OIM）培养基常规培养与传代，将第三代细胞用于实验。

1.4 方法

1.4.1细胞增殖试验MTT法测定七厘散含药血清对BMSCs的增殖的影响。将BMSC以1×104/孔的密度接种在96孔板中，并在α-MEM中孵育24 h，在加入七厘散含药血清后培养1、2、3、7、14天。在每个时间点，首先舍去上清液，每孔加入1mg·mL-1的MTT溶液，每孔100μL，37℃，5% CO2孵育4h后，再弃去上清，每孔加入150μL的DMSO，在酶标仪中震荡1～2min，560nm下测定其吸光度。

1.4.2ALP活性测定 当骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基（OIM）与七厘散含药血清的OIM中培养第1、2、3、7、14天时，各组的ALP活性使用ELISA试剂盒进行测定。

1.4.3RT-PCR检测Trizol提取细胞总RNA，并用mRNA反转录试剂盒，反转录成cDNA。取反转录产物进行实时荧光定量PCR。引物序列如下：Wnt4a F，5′AGCCTTCGTTGCTGTGGAGA3′，Wnt4aR，5′TGGTGTCATAAGGATGGTGG3′；Runx2F，5′AGGGTCCTACACATACTTCG3′，Runx2R，5′GGTCCTTGGTTAGCATTCTC3′；OsteocalcinF，5′CAAACTGCTAAATGACGAGG3′，OsteocalcinR，5′GGGAAAGGTTGTGTAGGGTC3′；β-ActinF，5′AGATCCTGACCGAGCGTGGC3′，β-ActinR，5′CCAGGGAGGAAGAGGATGCG3′；Wnt7F，5′ACATGGTCACGGAGCGTGGC3′，Wnt7R，5′CGGCCCATGATGAGTATCCT3′。我们使用β-肌动蛋白作为参考对照。Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt4a，Wnt7的相对mRNA水平表示为归一化为β-肌动蛋白mRNA的倍数变化，并根据2-ΔΔCt比较法。RT-PCR反应条件为：94℃、2min；53℃、20s，60℃、40s，共45个循环。GAPDH的cDNA经倍比稀释后进行同期PCR，用于回归分析。

1.4.4WesternBlot将培养了14d的BMSC使用含有苯甲烷磺酰氟（PMSF）的RIPA缓冲液裂解进行裂解后，通过BCA测定法定量蛋白质浓度。然后将所提的蛋白以30μg的量在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中分离，分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜2h，然后Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt4a，Wnt7抗体（均以1:2000稀释，含5%脱脂孵育牛奶）在室温下孵育2h。用TBST-Tween-20洗涤BMSC3次（每次5min），然后与二抗（驴多克隆抗兔）一起温育2h。通过增强的化学发光检测试剂检测，并用ChemiDocTMXRS化学发光成像系统记录。

1.5 统计学方法

采用SPSS12.0统计分析软件进行处理，数据表示为平均值±标准偏差（SD）。使用单向ANOVA评估结果，P值计算采用非配对双边t检验进行分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 七厘散含药血清显著促进BMSCs 增殖

MTT检测细胞活性结果表明，七厘散含药血清处理组在第1、2、3、7、14天时都能够促进骨髓基质细胞的增殖，但不具有显著性差异。与七厘散含药血清处理组相比，ICG001（5μM，25μM）组中BMSCs增殖程度明显降低，但差异无统计学意义。见图1。

图1 MTT测定分析BMSC增殖

2.2 七厘散含药血清增加ALP 活性

与对照组相比，七厘散含药血清处理组在第1、2、3、7、14天显著增加ALP活性且有统计学意义。与七厘散含药血清组相比，当加入抑制剂ICG001（5μM，25μM）后，其能明显抑制ALP活性，差异有统计学意义。见图2。

图2 4个组别的ALP 活性测定

2.3 七厘散含药血清增加Wnt /β-catenin 通路相关基因表达

PCR结果表明，与对照组相比，七厘散含药血清组能够显著上调成骨基因Runx2，Osteocalcin的表达以及Wnt/β-catenin信号通路相关。当加入抑制剂ICG001（5μM，25μM）后，七厘散含药血清的作用得到抑制，但是基因Wnt7以及Wnt4a未受到明显抑制。见图3。

图3 成骨诱导培养基培养14 d 后，七厘散含药血清和ICG001抑制剂对成骨基因在骨髓基质干细胞中表达的影响

2.4 ICG001抑制剂阻断Wnt/β-catenin 通路相关蛋白的表达

Westernblot结果显示七厘散含药血清显著上调Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt7和Wnt4a表达。加入抑制剂ICG001（5μM，25μM）后阻断Runx2，Osteocalcin，β-catenin表达，且具有统计学意义，但Wnt7和Wnt4a的表达未受影响。见图4。

图4 成骨诱导培养基培养14 d 后，七厘散含药血清和ICG001抑制剂对总β-catenin 蛋白在骨髓基质干细胞中表达的影响

3 讨论

报道[8]表明Wnt/β-catenin信号通路介导了BMSC向成骨细胞分化。Wnt/β-catenin信号传导是骨生物学的关键调节因子。然而，目前尚不清楚七厘散胶囊能否激活Wnt/β-catenin信号并促进骨髓间充质干细胞成骨。本实验探究七厘散对成骨基因和Wnt/β-catenin信号通路的相关基因表达的影响。研究发现七厘散可以提高Runx2，Osteocalcin，β-catenin，Wnt4a，Wnt7的mRNA水平。加入ICG001抑制剂后，Runx2，Osteocalcin和β-catenin的表达水平显著降低，25μMICG001具有更明显的抑制作用，但该抑制剂对Wnt4a和Wnt7表达没有影响，类似的结果在蛋白水平得到确证。其原因可能是因为ICG001主要针对β-catenin，而对更上游的蛋白Wnt7和Wnt4a的表达没有影响[9]。

综上所述，七厘散通过增加Runx2和Osteocalcin的表达而促进BMSCs的增殖和成骨分化，并激活Wnt/β-catenin信号传导增加成骨性，从而发挥治疗骨质疏松的作用。