基于大鼠胸膜炎模型对甘草附子汤的抗炎作用研究

曲 帅，阚 鸿，李金花，丁 茹，赵丽茹

（1.吉林省生物研究所药用真菌研究室，长春 130012；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；3.贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵阳 550014）

甘草附子汤源于张仲景的《伤寒论》，由甘草、黑顺片、白术、桂枝四味中药材组成，具有祛风除湿、温经散寒、温阳补中的功效，在临床上应用广泛，主要用于治疗风湿、类风湿性关节炎等病症，具有抗炎镇痛作用。文献报道[1]表明，甘草附子汤能够通过下调去卵巢磁性大鼠的破骨细胞CathK的表达，抑制成骨细胞ColI蛋白的降解，对骨质疏松症有一定的治疗作用。目前对甘草附子汤的药理学研究主要集中在利用佐剂型关节炎大鼠模型及胶原诱导关节炎小鼠模型来研究其抗炎机制[2-3]，但是尚无对其急性炎症作用机制的研究。炎症模型中，角叉菜胶诱导的急性胸膜炎是经典的急性炎症模型，因其对药物敏感且重现性较好，因此广泛应用于抗炎药物的筛选和评价中[4-5]。本研究观察甘草附子汤对急性胸膜炎模型大鼠的抗炎作用，通过检测相关的炎症介质，初步探讨甘草附子汤对急性炎症的作用机理，以期为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，购于辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：SCXK（辽）2015-0001，实验前适应环境饲养1周。

1.1.2药物与试剂 实验所用中药材甘草、黑顺片、白术、桂枝均购自长春福百草大药房。甘草附子汤的制备以甘草:黑顺片:白术:桂枝按照1:2:1:2的比例，分别采用10倍蒸馏水和8倍蒸馏水进行回流提取，合并2次提取液后，减压浓缩成浸膏。灌胃给药时，以不同体积蒸馏水分别制备成不同浓度药液。角叉菜胶，上海源叶生物科技有限公司产品；丙二醛（MDA）测定试剂盒，总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒，一氧化氮（NO）含量测定试剂盒，大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒，南京建成生物工程研究所。醋酸地塞米松片，天津天药药业股份有限公司。

1.1.3仪器 酶标分析仪（DNM-9602），北京普朗新技术有限公司；凯特TG16B台式高速离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1造模及给药 将健康雄性SD大鼠随机分为6组，分别为正常对照组、模型组、醋酸地塞米松阳性对照组、甘草附子汤高、中、低剂量组，每组10只。醋酸地塞米松阳性对照组（3mg·kg-1），甘草附子汤高、中、低剂量组（13.2、6.6、3.3g·kg-1生药）分别灌胃相应浓度药物，连续灌胃7d，每天1次，正常对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。第7天于末次给药30min后，模型组及各给药组动物分别用乙醚轻度麻醉，仰卧位固定，剪去右侧肋上毛，用酒精消毒皮肤。在右上肢下第7、第8肋骨间皮肤用剪刀剪一小切口，暴露肋间肌肉，在肌肉切口处向右胸膜腔内注入1%角叉菜胶（2mL·kg-1），正常对照组注入等体积生理盐水，注射部位在左胸腔第6、第7助骨间，靠近锁骨中线处。扎针时扎破后阻力消失时，立即停止，需快速进行，以免损伤肺脏[6-7]。致炎4h后各组动物再灌胃给药或生理盐水1次。

1.2.2标本采集与检测 致炎8h后处死动物，剪开腹部皮肤暴露膈肌，用2mL生理盐水分3次从胸腔最上部冲洗，吸取胸腔两侧所有的胸腔积液，量取其体积并观察胸液的颜色状态。大鼠胸腔积液的体积由量取的体积减去冲洗的生理盐水计算而得。2000r·min-1离心10min，取上清液分别测定MDA、NO、SOD含量。沉淀物以生理盐水稀释，混匀进行白细胞计数。将胸膜炎模型大鼠中所取得的血清分离后，按试剂盒说明测定MDA、NO、SOD、IL-1β及TNF-a含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0分析数据，各组数据以均数±标准差（±s）表示，各组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草附子汤对急性胸膜炎大鼠胸腔渗出液与白细胞计数的影响

见表1。

表1 甘草附子汤对胸膜炎大鼠胸腔渗出液体积与白细胞计数的影响（±s，n= 10）

表1 甘草附子汤对胸膜炎大鼠胸腔渗出液体积与白细胞计数的影响（±s，n= 10）

注：与正常组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别 剂量/（g·kg-1生药） 渗出量/mL-1 WBC/（×109·L-1）正常对照组 0.15±0.04 1.59±0.63模型组 0.96±0.16## 11.23±2.76##地塞米松组 0.003 0.24±0.09△△ 2.53±0.60△△甘草附子汤组3.3 0.56±0.21△△ 6.23±2.19△△6.6 0.48±0.14△△ 5.56±3.33△△13.2 0.34±0.14△△ 4.39±2.08△△

2.2 甘草附子汤对急性胸膜炎大鼠胸腔渗出液中MDA、NO、SOD 含量的影响

见表2。

表2 甘草附子汤对胸膜炎大鼠胸腔渗出液中MDA、NO、SOD的影响（±s，n= 10）

表2 甘草附子汤对胸膜炎大鼠胸腔渗出液中MDA、NO、SOD的影响（±s，n= 10）

注：与正常组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量/（g·kg-1生药） MDA /（nmol·mL-1） NO/（μmol·L-1） SOD/（U·mL-1）正常对照组 — 6.20±1.30 5.34±1.23 90.72±3.33模型组 — 15.68±2.45## 23.35±5.16## 45.80±3.79##地塞米松组 0.003 10.74±2.46△△ 7.83±3.76△△ 79.04±3.12△△甘草附子汤组3.3 13.63±2.69 18.18±4.56△ 55.80±1.94△△6.6 13.16±2.60△ 16.57±4.98△△ 68.34±3.43△△13.2 12.17±2.81△△ 12.61±4.37△△ 81.52±5.50△△

2.3 甘草附子汤对急性胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD 含量的影响

见表3。

表3 甘草附子汤对胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD含量的影响（±s，n= 10）

表3 甘草附子汤对胸膜炎大鼠血清中MDA、NO、SOD含量的影响（±s，n= 10）

注：与正常组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量/（g·kg-1生药） MDA /（nmol·mL-1） NO/（μmol·L-1） SOD/（U·mL-1）正常对照组 — 7.49±1.10 14.53±3.19 103.99±2.63模型组 — 13.47±3.24## 23.15±3.81## 71.63±4.95##地塞米松组 0.003 8.22±2.10△△ 16.46±2.78△△ 90.37±2.96△△甘草附子汤组3.3 11.58±3.32 19.18±2.58△△ 78.52±3.00△△6.6 10.82±3.35 18.16±2.85△△ 79.61±2.83△△13.2 9.83±2.78△ 17.34±2.28△△ 89.03±3.88△△

2.4 甘草附子汤对胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影响

见表4。

表4 甘草附子汤对胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影响（±s，n= 10） （pmol·L-1）

表4 甘草附子汤对胸膜炎大鼠血液中TNF-a和IL-1β的影响（±s，n= 10） （pmol·L-1）

注：与正常组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量/（g·kg-1生药） TNF-α IL-1β正常对照组 — 168.43±25.37 85.18±16.38模型组 — 260.78±34.75## 153.83±31.17##地塞米松组 0.003 189.62±31.77△△ 102.37±27.18△△甘草附子汤组3.3 230.88±43.00 157.66±35.70 6.6 246.92±53.96 145.62±24.39 13.2 221.05±25.13△△ 126.09±23.86△

3 讨论

研究[8]表明，炎症的发生和发展与自由基的损伤密切相关，氧自由基可与不饱和脂肪酸生成过氧化脂质，过氧化脂质可进一步分解为MDA等，因此MDA的含量可评价机体被脂质过氧化的程度。实验结果表明，甘草附子汤高剂量组可抑制大鼠胸膜炎模型胸腔组织液和血液中的MDA，甘草附子汤低剂量组对其抑制作用无统计学意义，提示甘草附子汤的抗炎作用可能与抗氧化作用有关系，并且与剂量相关。SOD可在体内清除超氧阴离子，它的活性高低反映了机体清除氧自由基的能力，即机体的抗氧化能力。实验结果表明高剂量的甘草附子汤可通过提高大鼠胸膜炎模型胸腔组织液和血液中的SOD活性，提高机体的抗氧化能力，进而起到抗炎的作用。

NO可在炎症反应的许多环节中发挥复杂的调节作用，炎症发生时，致炎物或炎症介质可诱导或增加局部NO的合成和释放，进而促进炎症反应如血管扩张充血、水肿等。通过检测NO的含量，我们发现，甘草附子汤中、高剂量组均可显著降低大鼠胸膜炎模型胸腔组织液和血液中NO的含量，因此表明甘草附子汤可通过降低NO的水平对炎症起到一定的抑制作用。

TNF-α主要由巨噬细胞产生，可诱导内皮细胞表达黏附分子，促进白细胞与血管内皮黏附、渗透，从而导致局部炎症，是一种重要的促炎性因子和免疫调节因子，是调节炎症的使动因素，可引起细胞死亡和组织损伤，参与人体多种急、慢性炎症疾病的发生和发展[9-11]。IL-1也是参与炎症反应最重要的细胞因子之一，可以通过诱导巨噬细胞COX-2基因的表达，使前列腺素的分泌增加而参与介导急性炎症反应；增加合成趋化因子，促进大鼠体内多形核白细胞向局部炎症部位聚集[12]；还能诱导出与TNF-α相似的生理和代谢改变，并与TNF-α产生相互协同作用，TNF-α还可以激发血管内皮因子释放，刺激血管内皮细胞的合成，并表达IL-1β，同时IL-1β可以作用于TNF-α，加重TNF-α对内皮细胞的损害作用，促进炎症细胞在损伤区聚集[13-15]。IL-1还可以直接作用于下丘脑发热中枢引起发热，刺激肝细胞分泌急性期蛋白，从而表现出急性炎症的特征[16]。IL-β在中性粒细胞趋化、激活过程中起重要作用，是调节炎症的始动因素和炎症反应的重要介质，主要存在于关节内，因此研究甘草附子汤对大鼠IL-β的调节作用，对阐明其治疗风湿和类风湿性关节炎疾病机理有重要提示作用[11]。此外，研究[17]表明TNF-α、IL-1β在胸膜炎炎症调节中可发挥重要作用。甘草附子汤高剂量组可降低胸膜炎模型大鼠血液中IL-1β和TNF-α的含量，尤其可显著降低TNF-α的合成和分泌，提示甘草附子汤的抗急性炎症机理可能与抑制这2种炎症因子的作用达到抗炎的效果相关。

本实验表明，甘草附子汤对急性炎症胸膜炎具有较好的抑制作用，尤其是高剂量组效果显著，其抗炎作用机理可能与甘草附子汤具有抗氧化成分，能够提高SOD的活性，减少MDA的生成以及能够抑制NO、TNF-α、IL-1β炎性介质的释放有关。本研究可为开发拓展甘草附子汤的临床应用奠定理论基础，但是由于炎症是一个比较复杂的病理过程，受到机体多因素的影响，因此需要进一步从药效物质基础、毒理学等多方面多角度进一步揭示其作用机制。