低功率超声醇提薄荷总黄酮工艺优化及抗氧化活性研究

肖牧原

（安徽省食品药品信息与举报中心，安徽 合肥 230051）

薄荷味辛、性凉[1]，常用于治疗头痛、牙痛、伤寒、目赤、喉痹、荨麻疹、咽喉肿痛等病症[2]。其含大量黄酮类物质，有抗自由基和抗氧化作用，治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）、老年性痴呆、癌症等也有一定效果。近年来，关于薄荷中黄酮类化合物的研究备受关注，多种相关药品[3]和保健食品随之上市。薄荷总黄酮的常见提取方法为回流提取法，操作简单，提取温度稳定，但提取时间长，耗能大，对产品结构有影响，提取效率不高。超声波提取法利用超声波所产生的高速、强烈空化效应，破坏动植物的细胞，加快提取剂的渗透作用，从而在较短时间内得到较高提取率[4]，但超声波的功率过高也可能破坏分子结构[5-6]。本研究中采用低功率超声法提取薄荷总黄酮，在单因素试验的基础上，采用响应面法[7]优选最佳醇提工艺，并采用Fetion 反应考察薄荷总黄酮的抗氧化活性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：UV-1100 型紫外-可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；JK-100DVE 型双频数控超声波清洗仪（合肥金尼克机械制造有限公司）；FW100 型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；FQA2104BS 型电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）。

试药：薄荷购于安徽省亳州市康美中药城；芦丁对照品（批号为20191228，纯度＞98% ）购于合肥博美生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线绘制

参考文献[8]制备质量浓度为0.2 mg/mL 的芦丁对照品溶液，分别移入含芦丁对照品1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 的50 mL 容量瓶中，加水稀释至12 mL，然后加入1 mL 5 % NaOH 溶液，再加入1 mL 10 %NaNO2溶液，摇匀，静置10 min，加入10 mL 4 % Al（NO3）3溶液，充分显色，加水定容，测量508 nm 波长处的吸光度（A），以A为纵坐标、质量浓度（C）为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。

1.2.2 薄荷总黄酮提取率计算[9-10]

按1.2.1 项下方法进行显色反应，测定A，根据标准曲线查找对应的质量浓度，代入公式Y=CVN/ （M×1000） ×100%计算薄荷总黄酮的提取率。其中Y为提取率（%），C为待测物质量浓度（mg/mL），V为提取液的体积（mL），N为稀释倍数，M为样品质量（g）。

1.3 单因素试验[11-13]

将阴干后的薄荷药材样品粉碎后过筛，称取1.00 g，精密称定，置相同规格比色管中，保持恒定的提取温度（50 ℃）和超声波功率（100 W），选取乙醇的体积分数、液料比和提取时间作为影响因素，每个因素确定6 个水平，分别进行3 次平行试验（见表1）。抽滤后取2 mL 滤液按1.2.1 项下方法显色，测定508 nm 波长处的吸光度，并按1.2.2 项下公式计算总黄酮提取率。

表1 影响因素及水平条件Tab.1 Influencing factors and their levels

1.4 响应面试验设计[14-16]

根据单因素试验结果，将乙醇体积分数、液料比和提取时间设定为因素A、因素B、因素C，每个因素的3 个水平编码为+1，0，-1，设计3 因素3 水平的响应面试验，试验方案见表2。

表2 响应面试验设计方案Tab.2 Design of response surface methodology

1.5 抗氧化活性试验[17-19]

根据Fetion 反应，H2O2溶液和Fe2+生成具有较高反应活性的羟基自由基（·OH），·OH 与水杨酸反应，生成2，3-二羟基苯甲酸（显色反应机制见图1）。2，3-二羟基苯甲酸的紫外可见吸收峰出现在510 nm 波长处，故将检测波长换为510 nm，按1.2.1 项下方法操作，得回归方程A=10.475C-0.0077，R2=0.99892（n=5），质量浓度线性范围为0.004 ～0.020 mg/mL。但当体系中有其他物质也能与·OH 反应时，就会存在与水杨酸的竞争反应，从而降低2，3-二羟基苯甲酸在体系中的质量浓度，510 nm 波长处的吸收峰会相应减小。

图1 显色反应机制Fig.1 The mechanism of color reaction

用固定反应时间的方法，在5 根比色管中均加入9 mmol/L 的H2O2、FeSO4溶液、水杨酸乙醇溶液各1 mL，将薄荷总黄酮提取液分别稀释至20%，40%，60%，80%，100 %，各取1 mL，在35 ℃条件下，水浴40 min，测量508 nm 波长处的吸光度（AX），并以去离子水作空白对照，同法得空白吸光度（A0），由于样品溶液本身具有吸光度，测其本底值时用超纯水作本底对照，同法得本底吸光度（AX0），计算清除率（P）。P= [A0-（AX-AX0）]/A0×100%。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数

结果见图2。随着乙醇体积分数从20%升至40%，薄荷总黄酮的提取率逐渐升高，当乙醇体积分数继续上升，提取率反而快速下降。主要原因可能是乙醇的体积分数对提取液极性的影响。40 %乙醇的极性与被提取化合物的极性最接近，相似相容的效果最好，当乙醇体积分数小于或大于40 %时，薄荷总黄酮类化合物的溶解性变小，同时部分脂溶性物质的溶解度增加，使得薄荷总黄酮类化合物不能完全浸出[20]。故40 %乙醇体积分数为最佳。

图2 体积分数与提取率的变化关系Fig.2 Relationship between volume fraction and extraction rate

2.1.2 液料比与提取率的变化关系

结果见图3。薄荷总黄酮的提取率随着液料比的增大，先增后减。液料比为20 ∶1 时提取率达到最大值，之后下降。因为随着溶剂量增多，传递功率增大，薄荷总黄酮在溶剂中分散量增大。同时，扩散溶解和吸附是固相和液相两者之间的动态平衡，当体系产生的热量相同时，液料比的增大会降低提取液的温度，此时吸附作用增强，提取率会下降。故20 ∶1 为合适液料比[21]。

图3 液料比与提取率的变化关系Fig.3 Relationship between the liquid-material ratio and extraction rate

2.1.3 提取时间与提取率的变化关系

结果见图4。薄荷总黄酮提取率在提取90 min 时达到峰值，90 min 前，由于升高温度可增大溶解性，提取率与时间呈正比，但提取时间过长，黄酮类化合物可能会发生系列化学变化，产生新的物质，从而导致提取率减小。故提取时间在90 min 左右为宜[22]。

图4 提取时间与提取率的变化关系Fig.4 Relationship between extraction time and extraction rate

2.2 响应面法优化工艺

响应面试验因素水平及结果见表3、表4，运用Design-Expert8 软件对结果进行拟合分析，得方程Y=3.65-0.00295A +0.29B +0.086C +0.01AB +0.078AC- 0.015BC-0.18A2-0.47B2-0.32C2。对该模型进行方差分析和显著性检验分析[23]（见表5、表6），显示该模型的失拟项不显著，说明模型能较好地对工艺进行模拟。模型回归的F值为12.77，概率P值为0.001，表明模型具有显著性。表中数据显示，B 和B2两项有极显著影响（P＜0.001），A2和C2两项有显著影响（P＜0.05），而A，C，AB，AC，BC 项的影响不显著。校正决定系数为0.8689，表明方程拟合度较好。变异系数为4.58%，说明试验精确可行。决策系数为0.9426，说明模型响应值的变化94.26%来自所选的因变量，回归方程能较好地描述其与响应值之间的关系。

表3 响应面试验因素水平及编码Tab.3 Factors′ levels and coding of response surface methodology

表4 响应面试验结果Tab.4 Results of response surface methodology

2.3 响应曲面分析

结果见图5 至图7。3 个响应曲面均向下，具有最高的极值点。同时，等高线的中心在所选2 个因素的变化范围内，说明响应值在3 个因素设计的范围内存在最大值。图5、图6 中的等高线呈椭圆形，说明各图2 个影响因素间的交互效应较显著，图7 中的等高线呈圆形，则说明2 个影响因素间的交互效应不显著。

表6 回归模型方差分析Tab.6 Analysis of variance of regression model

图5 乙醇体积分数和液料比的交互影响Fig.5 Interaction of ethanol volume fraction and liquid-solid ratio

图6 乙醇体积分数与提取时间的交互影响Fig.6 Interaction of ethanol volume fraction and extraction time

图7 液料比与提取时间的交互影响Fig.7 Interaction of liquid-solid ratio and extraction time

2.4 最佳工艺条件确定

根据回归模型，预测在50 ℃温度条件下，100 W 超声提取薄荷总黄酮时最佳工艺条件为乙醇体积分数41.14%，液料比21.57 ∶1（mL/g），提取时间91.4 min，此时提取率为3.585%。为进一步确定模型的可行性，将最佳提取工艺修正为乙醇体积分数41 %，液料比22 ∶1（mL / g），提取时间92 min，进行4 次验证试验，结果提取率分别为3.486% ，3.339% ，3.452% ，3.363%，平均为3.426%，与理论预测值的标准误差为3.04%，证明通过响应面法优化所得最佳工艺条件真实可靠。

2.5 抗氧化活性分析

随着薄荷总黄酮质量浓度的增大，其对羟基自由基的清除能力也呈快速上升趋势。当自由基清除率达50%后，清除率随薄荷总黄酮的质量浓度变化逐渐趋于平缓。详见图8。

图8 薄荷总黄酮质量浓度对自由基清除率的影响Fig.8 Effect of the concentration of total flavonoids from Mentha haplocalyx on the scavenging rate of free radical

3 讨论

本研究中在低功率超声作用下优选乙醇浸提薄荷总黄酮的工艺，首先通过单因素试验初步考察了乙醇体积分数（A）、液料比（B）和提取时间（C）3 个因素的工艺参数范围，然后运用响应面法进行工艺参数的优化。结果分析显示，100 W 超声作用下，50 ℃时，最佳的薄荷总黄酮提取工艺条件为，以41.14 %乙醇、液料比21.57 ∶1（mL/g）提取91.4 min，所得薄荷总黄酮的提取率为3.585%。抗氧化活性试验结果表明，该提取物能去除50%的羟基自由基，具有稳定的抗氧化活性。本研究结果为薄荷总黄酮的提取和生产提供了参考。