粘质沙雷氏菌FZSF02 中转录调控因子OmpR 的生物学功能
2021-03-04贾宪波刘方晨林俊杰陈济琛
贾宪波，刘方晨，赵 恪，林俊杰，方 宇，陈济琛 *
（1. 福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建 福州 350003；2. 福建农林大学资源与环境学院，福建 福州 350001；3. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350001）
0 引言
【 研究意义】 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）是肠杆菌科中的一类革兰氏阴性短杆状细菌，该菌在土壤、水体等环境中广泛分布[1]。粘质沙雷氏菌发现于1819 年，20 世纪70 年代确认该种中某些菌株为条件致病菌[2]。近年陆续发现，粘质沙雷氏菌可以产生多种有潜力的次生代谢物质，如肽类抗生素，生物表面活性剂serrawettin W1 和灵菌红素[3−5]等。该菌也可作为底盘微生物高产N-乙酰神经氨酸[6]、乙偶姻和丁二醇等高附加值产品[7−8]。因此，粘质沙雷氏菌已成为有重要前景的工业微生物菌种，研究其产物合成及调控相关基因以揭示其产物合成机制有助于挖掘其生产潜力。【前人研究进展】灵菌红素类物质由于具有抗菌和抗肿瘤等生物活性而成为近年研究热点，粘质沙雷氏菌是特异性产灵菌红素的最主要菌种[9]。研究表明，粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受多个基因调控，包括细菌群体感应相关基因，双组分系统相关基因和其他调控基因[10]。双组分调控系统广泛存在于细菌中，参与压力响应、细菌形态、 运动性、 菌毛合成及毒力表现等[11]，典型的双组分系统由作为传感器的跨膜组氨酸激酶和作为效应分子的一个细胞质蛋白组成[12]。目前已知双组分系统PigQ/PigW、PhoB/PhoR 和EepR/EepS 正调控粘质沙雷氏菌灵菌红素的合成[13−15]，双组分系统RssB/RssA[16]对灵菌红素的合成起到负调控作用。更多灵菌红素合成相关调控基因的揭示有助于理解该类菌株合成灵菌红素的调控机制和规律。【本研究切入点】EnvZ/OmpR 是一个典型的双组分调控系统，但是其对粘质沙雷氏菌灵菌红素合成及其他生物学特性的影响知之甚少。【拟解决的关键问题】利用从一株高产灵菌红素粘质沙雷氏菌FZSF02 菌株[17]的Tn5 转座子突变体库中获得一株ompR突变株，检测ompR敲除对菌株生物学特性的影响，初步揭示EnvZ/OmpR 双组分调控系统对粘质沙雷氏菌的作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌DH5α 由本实验室保存，粘质沙雷氏菌FZSF02 由本实验室自土壤中分离，粘质沙雷氏菌FZSF02ompR:: Tn5 源自本实验室由FZSF02 构建的Tn5 转座子突变体库。
1.1.2 主要试剂和仪器 供试培养基及抗生素购自生工生物工程（上海）股份有限公司，高保真DNA 聚合酶 PrimeSTAR®Max DNA Polymerase（Takara，R045A），克隆试剂盒Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit 购自北京艾德莱生物科技有限公司， 转座子突变试剂盒EZ-Tn5™
1.2 试验方法
1.2.1 目的基因的序列分析 调取目的基因的编码蛋白序列，通过NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站中blastp 功能比对查找与目的蛋白同源的蛋白序列并预测蛋白的功能，挑选隶属不同种属的同源蛋白序列，应用MEGA5.0 软件Neighborjoining 法构建该蛋白的系统发育树。
1.2.2 电击转化感受态细胞的制备 LB 琼脂平板上挑取FZSF02 菌株1 个单菌落置于50 mL 液体LB 培养基中，37 ℃、180 r·min−1培养12 h 作为种子液，以1% （v/v）的接种量转接至50 mL 液体LB 培养基中37 ℃，180 r·min−1培养至OD600约1.0 时将盛有菌液的摇瓶冰浴30 min，冰浴结束后转移至50 mL 离心管于4 ℃离心机中5 000 r·min−1离心10 min；弃上清后用40 mL 预冷的无菌水洗涤后4 ℃离心10 min，重复用无菌水洗涤离心1 次；用40 mL 的冰预冷的10%甘油洗涤后4%离心10 min，重复用10%甘油洗涤离心一次；用0.5 mL，10%甘油悬浮菌体沉淀，以100 μL 每管分装至1.5 mL 离心管后保存在−80 ℃备用。
1.2.3 突变株及敲除菌株的获得ompR突变株的构建应用转座子突变试剂盒EZ-Tn5™
表1 供试引物Table 1 Primers used in this study
1.2.4 细菌生长曲线测定 挑单菌落至50 mL 液体培养基中，37 ℃、180 r·min−1培养FZSF02 野生型菌株WT 和基因敲除菌株ΔompR过夜作为种子液，调整种子液含量至OD600为1.0，分别以0.5%的接种量转接WT 和ΔompR至50 mL 的LB 液体培养基中，分别于27 ℃和37 ℃，180 r·min−1培养，每隔3 h 取样测定菌液的OD600值，绘制生长曲线。
1.2.5 产灵菌红素能力的检测 用接种环分别挑取野生型菌株WT，转座子突变菌株FZSF02ompR::Tn5 和基因敲除菌株FZSF02ΔompR划线于分为三区的LB 固体琼脂平板上，平板倒置于27℃的恒温培养箱中培养36 h 后观察菌株的产色能力。
1.2.6 qPCR 试验 用细菌RNA 提取试剂盒(TIANGEN，DP430)提取菌株的总RNA，应用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN，KR118）进行反转录获取菌株cDNA，应用TransStart®Green qPCR SuperMix （TransGen，AQ101）进行qPCR 扩增。qPCR以16SrDNA 作为内参基因（引物为16SF 和16SR），分别应用引物pigAF/pigAR，pigFF/pigFR 和pigNF/pigNR 检测灵菌红素合成基因簇中pigA，pigF和pigN基因的转录水平变化。qPCR 引物序列信息见表1。
1.2.7 细菌生物被膜形成能力测定 分别挑取WT和ompR 菌株单菌落至50 mL 液体培养基中，于37 ℃、180 r·min−1培养过夜作为种子液，调整2 个种子液含量至OD600值为1.0 后以0.5%的接种量转接至50 mL 的LB 液体培养基中，从接种后的培养基中吸取200 μL 至96 孔细胞培养板中分别置于27 ℃和37 ℃培养，设置多个复孔作为重复。培养36 h 测定各孔OD600后将培养板中的菌液吸出，用PBS 缓冲液清洗各孔5 次，倒置在滤纸上10 min 以彻底除去孔中的PBS，向各孔加入200 μL 1%的结晶紫染料，染色30 min 后吸出结晶紫，用PBS 清洗各孔5 次，倒置放置培养板10 min 除去残留的PBS，用200 μL 无水乙醇溶解各孔中的结晶紫，测定各孔OD595值。菌株的产膜能力用各菌株OD595/OD600值表示。
1.2.8 细菌运动性测定 配制琼脂含量分别为0.3%（m/V）和0.7%（m/V）的LB 琼脂平板，分别吸取2 μLOD600值为2.0 的WT 和ΔompR菌液滴至各平板的中心位置，置于27℃培养箱培养，观察琼脂含量为0.3%（m/V）的平板上菌株的游动（swimming）能力，0.7%琼脂平板上菌株的涌动（swarming）能力。
1.2.9 细菌产酶能力测定 制备脱脂奶粉含量为1%（m/V）的LB 琼脂平板用以检测蛋白酶产生能力，吐温80 含量为1%（V/V）的LB 琼脂平板用以检测脂肪酶产生能力，应用血琼脂平板检测菌株的溶血素产生能力。将2 μLOD600值为1.0 的菌液滴于琼脂平板上，置于27 ℃培养48 h 通过观察蛋白酶和脂肪酶酶活圈的有无和大小比较菌株的产酶能力；27 ℃培养24 h 和7 d 观察溶血素活性。
1.2.10 菌株胁迫耐受性测定 菌株的胁迫耐受性实验参考Brzostek 等[20]和Gao 等[21]的方法进行。菌株分别在pH 3.0 处理10 min、 55 ℃处理5 min、15 mmol·L−1过氧化氢处理10 min 和2 mol·L−1的氯化钠处理1 h 后稀释涂布LB 琼脂平板进行菌落计数，以不经胁迫处理的菌株的菌数作为对照，分别计算经各胁迫因素处理后菌株的存活率。
2 结果与分析
2.1 OmpR 序列分析
粘质沙雷氏菌FZSF02 菌株ompR基因有720 个碱基（NCBI 序列号：QJU42212.1），编码由239 个氨基酸组成的OmpR 蛋白。序列比对分析显示其氨基酸序列在不同物种间较为保守，与从前100 个目标序列（Max target sequences）中所选代表不同属种的20 株菌的相似性为99.16%～100.00%，系统发育树也显示出类似结果（图1）。其中，与3 株沙雷氏菌属菌株的序列相似性为100.00%，与大肠杆菌等其他序列相似性为99.16%～99.58%。
图1 粘质沙雷氏菌FZSF02 菌株OmpR 基于氨基酸序列的系统发育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis on OmpR from S. marcescens FZSF02 with its homologous proteins
2.2 基因敲除菌株的构建及鉴定
应用同源重组法构建ompR缺失菌株，挑取具卡那霉素抗性的疑似单菌落应用引物OmpRFF 和OmpRBR 验证，分别以FZSF02 野生株和Tn5 转座子突变株FZSF02ompR:: Tn5 作为对照。结果（图2）显示，以野生株FZSF02 基因组为模板扩增得到大小为720 bp 的单一条带，为ompR完整序列；以FZSF02ompR:: Tn5 基因组为模板扩增得到1 920 bp 的单一条带，该序列由1 200 bp 的Tn5 转座子序列和被其插入的720 bp 的ompR序列组成；以FZSF02ΔompR基因组为模板扩增得到大小为1 540 bp 的条带，该序列由ompR上游300 bp，下游300 bp 和中间940 bp 的卡那抗性基因组成。琼脂糖凝胶电泳和测序结果均表明由卡那抗性基因替换掉120 bpompR基因序列的ompR缺失菌株FZSF02ΔompR构建成功。
图2 粘质沙雷氏菌FZSF02 菌株ompR 基因敲除验证Fig. 2 Agarose gel electrophoresis identification of ompRknockout S. marcescens FZSF02
2.3 生长能力检测
生长曲线显示FZSF02 和FZSF02ΔompR在27 ℃（图3-A）和37℃（图3-B）条件下在LB 液体培养基中的生长能力相似。FZSF02 在27 ℃培养条件下24 hOD600值达到最大值6.60，48 h 降至6.13；菌株ΔompR24 h 最高值为6.44，48 h 降至6.27。37 ℃培养条件下，FZSF02 在第21 hOD600值达到最大5.74，此后逐步降低至48 h 4.1；ΔompR21 h 达到最大值5.80，48 h 降低至4.0。上述数据说明ompR基因的缺失对该菌的生长无明显影响。
图3 FZSF02 野生菌株与ompR 敲除菌株FZSF02ΔompR 的生长曲线Fig. 3 Growth curves of WT and ΔompR of FZSF02
2.4 OmpR 缺失对FZSF02 产灵菌红素的影响
LB 固体平板试验显示，ompR转座子插入突变菌株FZSF02ompR::Tn5 和缺失菌株FZSF02ΔompR均丧失灵菌红素产生能力（图4-A）。Pig 基因簇大小约20 kb，由14 个基因pigA-pigN按顺序排列；pigA，pigF和pigN分别是基因簇第1 个、第6 个和第14 个基因，上述三个基因的表达水平可以反映该基因簇总体表达水平。 qPCR 显示，FZSF02ΔompR菌株中灵菌红素合成基因簇中pigA，pigF和pigN基因的表达水平分别降低为野生型菌株的3.8%，2.0%和2.1%（图4-B），说明OmpR 对灵菌红素合成的影响是通过调控灵菌红素合成基因簇的转录实现的。
图4 OmpR 对Serratia marcescens FZSF02 产灵菌红素能力及灵菌红素合成基因表达的影响Fig. 4 Effects of OmpR on prodigiosin-producing ability and expressions of prodigiosin biosynthesis genes of S. marcescens FZSF02
2.5 ompR 缺失影响FZSF02 生物被膜形成能力
生物被膜测定结果显示ompR 部分缺失后生物被膜形成能力降低，37 ℃培养条件下FZSF02ΔompR的生物膜量较FZSF02 野生型菌株降低37.5%（P＜0.01)，27 ℃培养条件下生物被膜量降低15.1%（P＜0.01)，表明OmpR 参与了该菌生物被膜的合成（图5）。
图5 OmpR 对Serratia marcescens FZSF02 生物膜合成能力的影响Fig. 5 Effect of OmpR on biofilm-producing ability of S.marcescens FZSF02
2.6 OmpR 对FZSF02 运动和产酶能力的影响
检测野生型菌株和基因敲除菌株FZSF02 ΔompR在琼脂含量为0.3%的LB 平板上的游动能力（swimming），菌株FZSF02 和ΔompR的菌落直径分别为7.32 cm 和7.18 cm；在0.7%琼脂含量的LB平板上的涌动能力（swarming）试验显示FZSF02 和ΔompR的菌落直径分别为5.51 cm 和5.67 cm，数值无显著性差异（图6），说明OmpR 对该菌的运动性无明显影响。野生型菌株WT 和FZSF02ΔompR均有产蛋白酶能力（酶活圈直径分别为2.1 cm 和2.2 cm）（图7-A）和脂肪酶能力（酶活圈直径分别为1.6 cm和1.7 cm）（图7-B），从酶活圈直径评价二者产酶能力无明显区别。WT 和FZSF02ΔompR溶血能力相似，在培养第24 h 时均无明显溶血圈（图7-C），培养至第7 天时都产生微弱的溶血圈（图7-D）。
图6 Serratia marcescens FZSF02 和FZSF02ΔompR 的运动能力Fig. 6 Mobility of S. marcescens FZSF02 and FZSF02ΔompR
图7 Serratia marcescens FZSF02 和FZSF02ΔompR 的产酶能力Fig. 7 Enzyme-producing abilities of S. marcescens FZSF02 and FZSF02ΔompR
2.7 ompR 对FZSF02 响应胁迫的影响
检测了野生型菌株和基因敲除菌株FZSF02ΔompR在高温，低pH，高盐和强氧化环境下的存活能力。55 ℃高温处理后野生型菌株和∆ompR的存活率分别为0.15%和0.11%；pH3.0 条件下处理后存活率分别为22.72%和28.35%；2 mol·L−1NaCl 处理后的存活率分别为92.45%和90.65%；氧化剂0.22 mol·L−1H2O2处理后的存活率分别为22.40%和23.84%。说明上述胁迫条件下二者存活率无明显差异（表2）。
表2 胁迫条件下WT 与∆ompR 的存活率Table 2 Survival rates of WT and ∆ompR under stress（单位：%）
3 讨论与结论
本研究成功构建了粘质沙雷氏菌FZSF02 的ompR敲除菌株，通过对突变体和野生型的对比研究了OmpR 对粘质沙雷氏菌FZSF02 灵菌红素产生能力，生物膜形成能力，产酶能力，运动性和适应胁迫等生物学特性的影响。
粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受已报道的30 多种基因调控[22]，双组分调控系统是其中重要的一类调控基因。目前在粘质沙雷氏菌菌株中发现的参与色素合成调控的双组分系统有PigQ/PigW[13]（与BarA/UvrY 系统高度同源[23]）、PhoB/PhoR[14]、RssB/RssA[16]和 EepR/EepS[15]。PigQ/PigW，PhoB/PhoR 和eepR/eepS双组分系统是通过效应蛋白直接与pigA上游启动子区结合激活灵菌红素基因簇的表达而正向调控灵菌红素合成[13−15]；RssB/RssA 调控系统通过RssB 与pigA上游启动子直接结合抑制灵菌红素基因簇表达从而负调控灵菌红素的合成[16]。本研究EnvZ/OmpR 双组分调控系统效应蛋白基因ompR敲除后菌株完全丧失灵菌红素合成能力，对pigA-N 基因簇中分别处于基因簇上游、中游和下游的pigA、pigF和pigN基因转录水平应用qPCR 检测，结果显示ompR敲除菌株中灵菌红素合成基因簇中3 个基因转录水平明显降低，说明转录调控因子OmpR 正调控该菌株灵菌红素的合成，该调控可能通过影响整个基因簇的转录实现。ompR是本研究新鉴定的参与粘质沙雷氏菌灵菌红素合成调控的双组分系统效应基因，有别于已报道的其他4 种双组分调控系统，其是否与PigQ/PigW，PhoB/PhoR 和eepR/eepS双组份系统类似通过与pigA 上游启动子直接结合从而正调控灵菌红素基因簇的表达有待通过凝胶迁移试验和DNaseI 足迹试验等进一步研究。
OmpR 对多种微生物生物膜的形成有重要影响。ompR缺失或突变降低大肠杆菌[24−25]，Yersinia enterocolitica[26]和 肠 炎 沙 门 氏 菌Salmonella enteritidis[27]生物被膜的形成，但是对Acinetobacter baumanniiStrain AB5075 生物被膜形成能力无影响[28]。菌株FZSF02ompR缺失菌株生物被膜形成量在37 ℃时降低37.5%，降低程度与Yersinia enterocolitica的ompR突变株类似（降低33%）[26]，小于肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis（降低75%以上）[27]。上述结果暗示OmpR 对细菌生物被膜形成的影响有一定的普遍性。
OmpR 影响细菌多个微生物学特性，虽然在不同种属间OmpR 序列高度保守，但是在不同菌株中其作用不同甚至相反。ompR敲除后Acinetobacter baumanniiStrain AB5075 的游动和涌动能力下降[26]，但是在Xenorhabdus nematophila[29]中运动能力显著增强。Xenorhabdus nematophila ompR基因敲除菌株蛋白酶，脂肪酶和溶血能力均明显增强[29]；Yersinia enterocolitica菌株ompR基因敲除后对高盐渗透压、低pH、过氧化氢和高温胁迫条件的适应性均明显降低[20]；但是Yersinia pestisompR基因敲除菌株对高盐、低pH 和高温条件较野生型菌株更为敏感，但是对过氧化氢耐受性增强[21]。本研究对菌株FZSF02 上述生物学特性进行探讨，显示ompR敲除后该菌运动性，产酶能力及环境胁迫的适应性均无明显变化。说明OmpR 在粘质沙雷氏菌FZSF02 菌株中功能与已报道的菌株不同，这反映了OmpR 在不同微生物中调控功能的多样性和复杂性。
综上，本研究发现在粘质沙雷氏菌FZSF02 菌株中OmpR 特异性正调控灵菌红素的合成，同时一定程度上影响生物被膜的形成。EnvZ/OmpR 代表一个新的灵菌红素合成调控系统，其具体调控机制有待深入研究。
