地黄饮子脑脊液对M146L细胞活力及细胞凋亡的影响

姚辛敏，关慧波，于淼，王琪，周妍妍

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD) 是一种进行性认知损害为特征的神经变性病，起病隐匿，是老年性痴呆中最常见的原因, 占所有痴呆原因的60%～80%[1]，中医临床以肾虚痰浊为主证，中医学理论认为AD的基本病机为肾虚痰阻。地黄饮子是补肾化痰的经典方剂，首见于《黄帝素问·宣明论方》。现代临床报道和实验研究均显示其对AD治疗有很好疗效[2-3]。课题组前期在体实验与离体实验研究证实[4-8]，地黄饮对Aβ导致的AD动物模型和细胞模型能够通过血脑屏障，直接作用于大脑病变组织，保护神经细胞，维持细胞活力，对细胞凋亡具有抑制作用。为证实地黄饮子在双转染AD细胞模型中的细胞保护作用进行了本实验研究。

1 实验材料

1.1 细胞株

CHO(中国仓鼠卵巢细胞)购自上海中乔新舟生物科技有限公司;293T(人胚肾细胞)购自中国科学院细胞库;M146L细胞由沈阳万类生物转染并鉴定。

1.2 实验动物

体质量2～3 kg健康雄性大耳白家兔10只，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK黑2008-004。于23 ℃、45%湿度下清洁级实验室适应性饲养3 d，自由进食、饮水。

1.3 实验药物

地黄饮子药物组成熟地黄、山茱萸、肉苁蓉、石斛、麦冬、五味子、石菖蒲、远志、茯苓、肉桂、炮附子和巴戟天各20 g，生姜、大枣、薄荷各5 g，购于黑龙江中医药大学附属第一医院。所有饮片加10倍水浸泡2 h，煎煮1 h后滤出药液，再加10倍水煎煮，1 h后取汁，将2次药液混合，浓缩成每毫升含生药1.67 g的混悬液，分装,4 ℃保存备用。

1.4 主要实验试剂与设备

DMEM培养基,美国Gibco;胎牛血清,美国Hyclone；PBS，中国双螺旋；胰酶，中国碧云天；双抗(青链霉素)，美国Gibco；脂质体2000、G418,美国Invitrogen；MTT、DMSO，美国Sigma；乳酸脱氢酶测定试剂盒，中国万类生物；细胞凋亡检测试剂盒，中国凯基。

CO2培养箱，上海力申；倒置相差显微镜、荧光显微镜，麦克奥迪；超净工作台，苏州净化；光度计，Thermo；酶标仪，上海科析；流式细胞仪，BD。

2 实验方法

2.1 细胞的培养条件

CHO细胞于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，按1∶2进行传代，使用由含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素)培养；M146L细胞于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，按1∶2进行传代，使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(800 μg/mL G418)培养。293T细胞：含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素)。

2.2 中药脑脊液的制备

体质量2～3 kg健康雄性大耳白家兔40只，适应性喂养3 d，随机分为4组，每组10只，分别为空白组和地黄饮子高、中、低剂量组。经预实验最终确定地黄饮子的给药浓度为生药1.67 g/mL，高、中、低剂量组分别按36 mL/kg、27 mL/kg、18 mL/kg体质量进行灌胃给药，空白组灌胃给服等体积的蒸馏水。灌胃前12 h禁食不禁水，每天灌胃1次，连续3 d，末次灌胃后1 h，采用3%戊巴比妥钠1 mL/kg经兔耳缘静脉麻醉，抽取脑脊液0.8～1.2 mL，注入经高压蒸汽灭菌的1.5 MLEP管中，并详细标记，-80 ℃冰箱冻存备用。使用前室温解冻，将同组家兔的脑脊液混合，用0.22 μm微孔过滤器过滤除菌。

2.3 实验分组及脑脊液处理方法

待M146L细胞密度至90%左右，PBS清洗1次。弃PBS，加胰酶，细胞变圆后，加完全培养基。吹打细胞，收集至离心管，离心(800 rpm，3 min)。弃上清，将M146L细胞分为4组，分别为模型组、中高组、中中组、中低组，除去原培养液，分别加入10%空白脑脊液，10%地黄饮子高、中、低剂量含药脑脊液各10 μL，再加入90 μL培养液。另设未经转染的CHO细胞作为空白组，加入正常培养液。按实验分组将细胞接种于培养板中，置培养箱内孵育24 h后用于指标检测。

2.4 各组细胞培养液中LDH含量的检测

蛋白质抽提：向各组细胞培养液中加1%Triton X-100裂解，离心(2 500 rpm，10 min)，小心吸取上清，-20 ℃保存，蛋白质定量后应用LDH试剂盒进行测定，波长450 nm，酶标仪测定OD值。

注：标准管浓度=0.2 μmol/μL。

2.5 MTT法检测各组细胞OD值

收集M146L细胞，并计数，按实验分组将细胞以2×103/孔接种于培养板中，每组设5个复孔，培养时间为1 d、2 d、3 d、4 d和5 d。到达相应时间后，向培养板中加入浓度为0.2 mg/μL的MTT继续孵育4 h～6 h。离心(1 000 rpm，10 min)，去上清，加200 μL DMSO， 室温下摇床振荡10 min，充分溶解形成的结晶，在酶标仪上测定其在490 nm处OD值，进行数据分析。

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

将所有细胞经800 rpm离心5 min后收集，并小心吸除上清后用PBS洗涤2次，再小心吸除再次800 rpm离心5 min收集的细胞上清，约残留50 μL左右的PBS，将500 μL Binding Buffer注入到每管细胞样品中轻轻重悬细胞。先注入5 μL Annexin V-FITC混匀后，再注入5 μL Propidium Iodide混匀。室温避光孵育15 min之后即可进行流式检测。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 地黄饮子含药脑脊液对M146L细胞LDH含量的影响

与空白组比较，模型组细胞培养液中LDH含量显著升高，有统计学意义(P<0.01)，与模型组比较，中药各剂量组细胞培养液中LDH含量均显著降低，中低组有统计学意义(P<0.05)，中中组、中高组尤为显著(P<0.01)。见表1。

表1 各组细胞培养液中LDH含量比较

3.2 MTT法检测地黄饮子含药脑脊液对M146L细胞OD值的影响

与空白组比较，模型组OD值明显降低，有统计学意义(P<0.01)，与模型组比较，中药各剂量组OD值均显著升高，中低组有统计学意义(P<0.05)，中中组、中高组尤为显著(P<0.01)。见表2。

表2 各组细胞MTT检测结果比较

3.3 地黄饮子含药脑脊液对各组细胞凋亡的影响

与空白组比较，模型组细胞凋亡显著增加，具有统计学意义(P<0.01)，说明M146L细胞能够模拟AD细胞凋亡特征，与模型组比较，各地黄饮子脑脊液组的细胞凋亡率显著降低，具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，中高组和中中组优于中低组，中高组细胞凋亡最少，地黄饮子脑脊液可显著降低M146L细胞的凋亡率，呈剂量依赖。见表3和图1。

表3 地黄饮子含药脑脊液对各组细胞凋亡的影响

图1 给药后各组M146L细胞的流式细胞双参数散点图

4 讨论

地黄饮子是古代名方，出自刘完素的《黄帝素问宣明论方·卷二诸证门》，在《圣济总录》地黄饮子的基础上加薄荷而成。地黄饮子具有滋肾阴、补肾阳、开窍化痰的功效，适用于下元虚衰、虚阳上浮、痰浊上犯、阻塞窍道所致的喑痱证[9-11]。地黄饮子方药主要由三类药物组成,一类为滋阴药，熟地黄、山茱萸补肾益精、滋补肾阴；石斛、麦门冬、五味子滋阴敛液，壮水以济火；熟地黄补血养阴、填精益髓，为滋肾填精益髓之要药。再加薄荷以解郁、清利头目，增强本方轻清上行宣窍之力。生姜、大枣和胃补中，调和药性。本方即取孤阴不生，独阳不长之意，补阴补阳之药相互配伍，以达生精填髓之目的。

脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)是参与细胞能量代谢的一种重要的酶，能催化乳酸生成丙酮酸，并产生ATP。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，但当细胞受损或死亡时胞膜破裂，LDH就会从胞浆中释放出来，导致细胞质内LDH含量减少，培养液中LDH含量增多，所以细胞培养液中LDH的含量可直接反映质膜的完整性及细胞的神经受损程度，是检测细胞活性的重要指标。细胞培养液中LDH含量越多，就说明细胞膜越不完整、细胞受损程度越重[12]。

四噻唑蓝(Methylthiazoletetrazolium，MTT)比色法被广泛应用于生物活性因子的活性检测、细胞增殖和细胞毒性的检测，具有灵敏度高、重复性好、操作简便、快速经济等优点。MTT是一种黄色化合物，可与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，SDH)发生反应，被还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞不会发生此反应。二甲基亚砜(DMSO)可使甲瓒溶解，在酶标仪波长490 nm处测定其光吸收值(OD值)。在一定范围内，甲瓒结晶形成的多少与活细胞数成正比，即OD值越大，药物毒性越小，活细胞数越多。

流式细胞技术(Flow cytometry，FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。在细胞凋亡的早期阶段, 胞浆膜磷脂的不对称性丧失, 导致膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层, 从而可以被膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)特异Annex in-V探针所标记[13-14]。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特所有的, 也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的, 而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏[15-16]。碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的,而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此,Annex in-V结合PI 或 7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色,凋亡细胞可被标记上Annex in-V,坏死和凋亡晚期细胞可被Annexin-V和PI或7-AAD同时染色。

本实验选用了对各组细胞培养液中LDH含量的检测、MTT这两种方法观察了地黄饮子含药脑脊液对M146L细胞受损程度和细胞活力的影响，并结合流式细胞检测同时观察地黄饮子含药脑脊液对M146L细胞凋亡率的影响。各组细胞培养液中LDH含量的检测结果提示地黄饮子含药脑脊液具有保护细胞膜的作用。MTT结果显示，地黄饮子含药脑脊液给药后细胞活力增强。流式细胞计数检测结果提示，地黄饮子含药脑脊液可以抑制M146L细胞凋亡。

综上，实验结果表明地黄饮子含药脑脊液可以明显减轻M146L细胞的受损程度，提高细胞活力，增加活细胞数量，抑制细胞凋亡。