Nano-ZnO-PDA用于抑制龈下菌斑的体外研究*

符国富，韩小东，刘族志，林建能，赵永兴

(1.海南省儋州市人民医院，儋州 571700；2.解放军总医院海南分院，三亚 572013)

牙菌斑是基质包裹的互相黏附、或黏附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的细菌性群体，为不能被水冲去或漱掉的一种细菌性生物膜[1]。牙菌斑主要对牙和牙龈构成危害，也就是口腔最常见的两种疾病：龋病和牙周病。龈上牙菌斑牢固地附着在牙面上，细菌摄入唾液中的糖，分解糖产酸，这些酸会破坏牙齿，最终形成龋洞[2]。龈下牙菌斑中的细菌产生的毒素和其他有害物质会刺激牙龈，产生炎症，即牙龈炎。如不加控制，任其发展，牙龈炎有可能会发展为不可逆的牙周炎，引起牙槽骨的破坏，最终导致牙齿松动、脱落[3]。因此，抑制口腔中牙菌斑的形成可以有效预防龋病和牙周病。龈下菌斑中的细菌是以革兰阴性兼厌氧菌及专性厌氧菌为主，其代表性细菌为牙龈卟啉单胞菌，伴放线聚集杆菌等[4]。

氧化锌（ZnO）是少数几种通过FDA 认证的能在人体内应用的无机抗菌材料。同时，ZnO 材料在口腔医学领域被广泛运用，如垫底材料[5]、暂封剂[6]、牙周塞治剂[7]等。纳米氧化锌（nano-ZnO）粒子是粒径大小约为1～100 nm 的纳米颗粒，由于颗粒尺寸的细微化，小尺寸效应和表面效应等使其抗菌性能远优于传统ZnO材料[8]。nano-ZnO已被证实对革兰阳性菌和革兰阴性菌、真菌、原生动物和病毒均有作用[9]。近年来，细菌引发的各种疾病患病率不断升高，一些传统的口腔抗生素被报道均具有不同程度的耐药性[10]。nano-ZnO 由于其优异的广谱抗菌性，不产生耐药性，抗菌效果持久，且生物相容性优良，使用方便，在口腔医学的应用得到了越来越多的关注[11]。本研究旨在研究一种nano-ZnO 经聚多巴胺（PDA）改性后（nano-ZnO-PDA）对牙龈下菌斑中细菌的抑菌作用，将其可以添加到漱口水或者牙膏中，从而达到预防牙龈炎和牙周炎的目的。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

醋酸锌、四丁基溴化铵、盐酸多巴胺（DA）均购买于阿拉丁试剂有限公司；恒温水浴锅（B-220,上海亚荣生化仪表厂）；高分辨率透射电镜（JEM-2000FX Ⅱ，日本电子公司）；超净工作台（MINI-V，美国Thermo 公司）；生化恒温培养箱（DHP-360，北京市永光明医疗仪器厂）；厌氧培养箱（HYQX-II，上海跃进医疗器械公司）；CCK8（同仁，日本）。

1.2 nano-ZnO-PDA的制备

称取2.75 g醋酸锌，4.02 g四丁基溴化铵加入到250 mL 的圆底烧瓶中并加入150 mL 的无水乙醇，80 ℃恒温水浴锅内搅拌。1 h 后，将0.5g 氢氧化钾溶于5 mL 的无水乙醇中加入到正在反应的圆底烧瓶中继续搅拌，12 h 后取出，甲醇洗涤8 次，将制得的球状nano-ZnO（nano-ZnO 组），离心，真空冷冻干燥成粉末备用。以pH 值为8.5 的Tris-HCL 缓冲液为溶剂，配制2 g/L 的DA 溶液，将粉末nano-ZnO 浸入到该溶液中24 h 后取出纯水洗涤3 次，真空冷冻干燥后得到nano-ZnO-PDA 粉末（nano-ZnO-PDA组）。

1.3 nano-ZnO组和nano-ZnO-PDA组表面形貌

将nano-ZnO 组和nano-ZnO-PDA 组分散到纯水中，滴入铜网中，待自然干燥后做透射电镜观察其表面形貌，其工作电压为200 kV。拍摄SAED 衍射图分析其纳米晶体结构特征。

1.4 ZnO 组、nano-ZnO 组、nano-ZnO-PDA 组的体外抗菌性

吸取5 mL灭菌后的LB（肉汤）液体培养基作为溶剂，称取适量的样品（ZnO、nano-ZnO 和nano-ZnO-PDA）与其配制成1 000 μg/mL 的样品悬浮液，超声30 min 使3 种样品在培养液里分散均匀，然后放入紫外灯下照射30 min 消毒，备用。金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌经复苏后稳定培养3 d，此时菌落数量约为1×106CFU/mL（CFU为菌落形成单位）。

1.4.1 对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抗菌效果 将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌细菌悬液充分摇匀后，用移液枪吸取100 μL 细菌悬浮液置于分散好的3种样品悬浮液中，放置于温度为37 ℃的恒温生化培养箱中培养24 h 后将混合液取出摇匀，在超净工作台中取100 μL，用PBS 液按1∶10 比例稀释至一定倍数，然后吸取100 μL 稀释后的混合液均匀涂布在LB 琼脂固体培养基上，生化培养箱中培养24 h（37 ℃有氧条件下）。记录下每个平板上菌落的数量，统计数据时，根据稀释倍数计算原始的共混液中所含的细菌菌落总数。公式计算:R=(A-B)/A×100%（其中A 为对照组细菌数量，B 为实验组细菌数量）。每样本平行检测3次。

1.4.2 对牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌的抗菌效果 将牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌细菌悬液充分摇匀后，用移液枪吸取100 μL 细菌悬浮液置于分散好的3 种样品悬浮液中，放于温度为37 ℃的厌氧培养箱（80%N2，10%CO2，10%H2）中培养24 h后将混合液取出摇匀后取100 μL，用PBS 液按1∶10比例稀释至一定倍数，然后吸取100 μL 稀释后的混合液均匀涂布在LB 琼脂固体培养基上，37 ℃的厌氧培养箱（80%N2，10%CO2，10%H2）中培养24 h。记录下每个平板上菌落的数量，统计数据时，根据稀释倍数计算原始的共混液中所含的细菌菌落总数。每样本平行检测3次。公式计算:R=(A-B)/A*100%（其中A 为对照组细菌数量，B 为实验组细菌数量）。

1.4.3 3 种ZnO 对离体牙上金黄色葡萄球菌的抑菌效果 取3颗离体牙洗净后并放置于紫外灯下光照2 h 后灭菌备用，将金黄色葡萄球菌悬液充分摇匀后，用移液枪吸取100 μL 细菌悬浮液置于分散好的3 种样品悬浮液中，将灭菌后的离体牙置于细菌和样品混合液中共同培养24 h（37 ℃，有氧），取出各组牙齿用2.5%戊二醛固定，乙醇脱水，喷金后在扫描电镜下观察牙齿表面细菌的数量。

1.5 ZnO 组、nano-ZnO 组、nano-ZnO-PD 组A 的体外细胞毒性

3种样品紫外杀菌2 h，分别配制成1 000 μg/mL浓度的样品悬浮液，将人成纤维细胞培养至对数期，细胞密度为10 000/cm2，100 μL/孔接种样品悬浮液到96 孔细胞培养板，不加细胞组为空白对照组，细胞培养箱（37 ℃，5%CO2）中培养。每隔2 d 换液，用无菌PBS 平衡液洗涤细胞2 次，换用各组样品悬浮液继续培养。向每孔加入10 μL CCK8检测试剂，在细胞培养箱（37 ℃，5%CO2）中孵育6 h，酶标仪测定450 nm处吸光度，每样本平行检测3次，并计算细胞存活率（存活率(%)=OD450nm实验组细胞/OD450nm对照组细胞×100%）。

1.6 ZnO 组、nano-ZnO 组、nano-ZnO-PDA 组在小鼠体内组织毒性

通过小鼠灌胃给药实验并做组织病理切片检测3 种材料对小鼠的组织毒性，选6～8 周龄的雄性昆明小鼠9 只，每组3 只，饲养条件保持温度（22±1）℃、（60±10）%的相对湿度、12 h 的光照和黑暗循环交替，体重超过25 g 即可达到给药条件。给药前一晚禁食，采取灌胃给药的方式。将准备好的3 种材料置于5 mL 离心管中，采用超纯水作为分散剂，配制成浓度为40 mg/mL的悬浮液，超声分散30 min备用，使用前震荡摇匀3 min，给药剂量为每只鼠按照333.33 mg/kg·day-1，连续灌胃给药5 d，第6 天将小鼠处死，解剖取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，浸入到4%多聚甲醛固定液中固定。切片用苏木精－伊红（HE）进行染色，然后用光学显微镜观察不同样品对小鼠重要脏器系统的急性组织病理变化。

1.7 统计学方法

实验数据经SPSS20.0 统计软件处理，计数资料以频数或百分率（%）表示，率的比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 nano-ZnO 组和nano-ZnO-PDA 组的性状和微观形貌

水浴法合成的nano-ZnO 经冷冻干燥后为白色粉末状，经PDA 改性冻干后变成黑色，见图1；透射电镜和SAED 衍射图，见图2。nano-ZnO 的纳米直径在50 nm 左右，球状，表面光滑，经改性后nano-ZnO-PDA 球状形态保持稳定，纳米直径无明显变化，表面附有一层有机物质包裹。SAED 衍射图显示nano-ZnO 组为单晶结构，nano-ZnO-PDA 组为复合结构，表明PDA 已成功载入nano-ZnO 中，使原来的单晶结构的nano-ZnO 变为具有复合结构的nano-ZnO-PDA。

图1 nano-ZnO组和nano-ZnO-PDA组的性状

图2 nano-ZnO 组、nano-ZnO-PDA 组的TEM 图及SAED 衍射图

2.2 ZnO 组、nano-ZnO 组、nano-ZnO-PDA 组的体外抗菌结果

选用金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌4 种菌种作为代表菌，分析不同样品对4种细菌的抑菌率。对于金黄色葡萄球菌，3组抑菌率均在80%以上，但传统ZnO 组抑菌率低于nano-ZnO组和nano-ZnO-PDA组（P＜0.05），而nano-ZnO 组和nano-ZnO-PDA 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3A）。传统ZnO 组对绿脓杆菌的抑制效果不佳，而nano-ZnO 组和nano-ZnO-PDA组对其抑菌效果明显增加（P＜0.05）（图3B），同样，nano-ZnO 组和nano-ZnO-PDA 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。传统ZnO 组对于牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的抑菌作用一般，nano-ZnO 组和nano-ZnO-PDA 组对其抑菌效果有所增加（图3C、图3D）。nano-ZnO 组以及nano-ZnO-PDA 组的抗菌效果优于普通ZnO 组（P＜0.01），而nano-ZnO组和nano-ZnO-PDA 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 3种ZnO对不同细菌的抑菌率

将金黄色葡萄球菌与离体牙共培养，并加入3钟不同ZnO一起培养后，取出各组牙齿用2.5%戊二醛固定，乙醇脱水，喷金后在扫描电镜下观察牙齿表面细菌的数量。空白对照组中有大量的细菌黏附在牙齿表面，而传统ZnO 组细菌数量减少，nano-ZnO 组和nano-ZnO-PDA 组细菌数量更少，结果表明传统ZnO 对黏附在牙齿表面的金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，但抑菌效果低于nano-ZnO 和nano-ZnO-PDA，见图4。

2.3 ZnO 组、nano-ZnO 组、nano-ZnO-PDA 组的体外细胞毒性

CCK8 法测定各样品的在450 nm 的吸光度（OD）值，并得出各组的细胞生存率，见图5。与ZnO 组比较，nano-ZnO 组在第1、第3、第7 天对人成纤维细胞表现出一定的毒性，经PDA 改性后，毒性有所降低（P＜0.05）。

2.4 ZnO 组、nano-ZnO 组、nano-ZnO-PDA 组的体内组织毒性

通过小鼠灌胃实验并解剖其心肝脾肺肾做HE染色结果，见图6。各器官并未表现出明显的炎症和病理损害，说明3 种ZnO 经口腔途径进入小鼠体内短时间内并不会对小鼠的重要脏器产生明显的毒性作用。

图4 各组对牙齿表面金黄色葡萄球菌的抑菌效果

图5 3种ZnO第1、4、7天对人成纤维细胞的毒性

图6 3种ZnO的组织毒性（100×）

3 讨论

龈下菌斑中的细菌是导致牙龈炎，牙周炎的始动因素，控制菌斑是预防和控制牙周疾病的重要措施[12]。常规的刷牙并不能完全去除龈下细菌和菌斑，借助口腔抗菌剂是一种良好的菌斑控制方法。现今口腔抗菌剂有各种剂型，牙膏为最常见剂型之一。常见口腔抗菌剂包括氯己定、甲硝唑等[13]，而抗生素带来的不良后果主要是导致细菌耐药性，本研究采用nano-ZnO无机抗菌剂来作为口腔抗菌剂，不仅避免产生耐药性，而且抗菌效果更是优于口腔传统ZnO 材料，经过改性后，其细胞毒性也大大的降低，未来，nano-ZnO-PDA 有望作为口腔常用抗菌剂在人体得到广泛的应用。

本研究是通过水浴法合成直径为50nm 左右的nano-ZnO，可以均匀的分散在纯水中，nano-ZnO 以及nano-ZnO-PDA 的抗菌效果优于普通ZnO（P＜0.05），这是由于nano-ZnO 颗粒尺寸的细微化，小尺寸效应和表面效应等使其抗菌性能远优于传统ZnO 材料[14]。对于牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌，nano-ZnO与nano-ZnO-PDA比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。该实验表明，PDA 作为该nano-ZnO 的表面改性剂，不会影响其抗菌性能。然而，纳米材料由于本身颗粒尺寸小，容易进入细胞内部而造成毒性增加的缺点，有研究表明，PDA 可以黏附在各类有机物和无机物的表面，不仅能够保护基底免受微环境的影响，形成稳定的屏障，而且能够对基底实现功能化修饰，可控地改变基底性质，已被广泛应用于生物医药领域，如肿瘤治疗和药物传输等[15]。PDA 具有良好的生物相容性，容易形成稳定的屏障，有效的降低材料本身的毒副作用[16]，这为本研究选用PDA 作为nano-ZnO 的改性剂以降低纳米材料本身的毒性提供了理论依据。本研究利用DA 在弱碱性的条件下可以发生氧化自聚作用的特点，在nano-ZnO 表面键合形成PDA 层，PDA 层为材料表面的进一步功能化提供反应位点，从而达到材料改性的目的。经改性后形成的nano-ZnO-PDA 大大降低了纳米材料本身的细胞毒性，这与Scog‐namiglio 等[16]在一项用于外科手术的经多巴胺修饰的多聚糖膜的研究中的结果一致。

Nano-ZnO-PDA 复合纳米材料的制备方法简单，在抗菌性能以及生物相容性上表现出一定的优势，在未来，有望作为一种新型的纳米无机抗菌剂运用在口腔治疗和预防保健中，然而，我们对于其抗菌性还有必要的进一步研究，比如该材料对引起牙周疾病的其他致病菌如具核梭杆菌、福赛坦氏菌等是否有同样的抑菌效果，以及Nano-ZnO-PDA 需做进一步的体外和体内实验来验证其生物安全性。