二十二碳六烯酸微藻油乳状液稳定性的影响因素

杜 健，梁井瑞，韩宗正，任建威，赵 媛，李 伟，王 剑，冯晓慧

（枣庄学院食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160）

二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）是一种人体必需的多不饱和脂肪酸，具有益智健脑、调节免疫功能等作用，常作为婴幼儿配方奶粉和食品添加剂[1-3]。与鱼油DHA相比，来源于微藻的DHA因结构简单、易吸收等优点被广泛利用[2,4-5]，但易氧化变质的特点严重限制了其在食品生产中的应用[6-8]。常用的解决方法是通过喷雾干燥等手段，利用一些壁材将DHA微藻油以微胶囊包埋的形式添加在产品中，以提高其氧化稳定性[9-11]。

DHA微藻油微胶囊产品品质不仅取决于其制备工艺，还与乳状液的稳定性紧密相关[12-13]。DHA乳状液是典型的水包油（O/W）型，属于热力学不稳定体系[14]。乳状液稳定性与乳状液特性（如界面张力、油-水界面膜、液滴大小和连续相黏度等）密切相关[15]。在乳状液制备过程中，加入乳化剂能够促进O/W型乳状液的形成。在生产中，常通过不同种类乳化剂复配方式提高乳状液的制备效率。乳化剂复配通常选择高或低亲水亲油平衡（hydrophile-lipophile balance，HLB）值乳化剂结合方式，此外，乳化剂类型和比例对乳状液状态有显著影响[16]。

以辛烯基琥珀酸酯化淀粉（octenyl succinic anhydride modified starch，OSAS）为壁材通过微胶囊化制成的产品安全性高、抗氧化性好，已经在欧美和亚太的很多国家中广泛应用[17-18]。OSAS分子中存在羧基（—COOH）[19]，在溶液中可以解离形成羧酸根离子。在乳状液制备过程中，其可被视作阴离子表面活性剂。因此，以OSAS为壁材制备乳状液，其水溶液能够形成羧酸离子，导致溶液的pH值与离子种类及浓度均有密切的关联。

本实验以DHA微藻油为原料，以OSAS和麦芽糊精为壁材，研究在微胶囊化过程中，乳化剂种类、pH值和金属离子对乳状液稳定性的影响及相应机制。以期获得高稳定性的DHA微藻油乳状液，从而为获得高质量的微胶囊产品并促进其在食品领域高效应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DHA微藻油由江苏天凯生物科技有限公司提供。

OSAS、麦芽糊精（均为食品级） 河南郑州成果添加剂有限公司；十二烷基硫酸钠 上海绪雅实业有限公司；重铬酸钾、乙醚（均为分析纯） 上海凌峰化学试剂有限公司；乙醇（分析纯） 上海九亿化学试剂有限公司；石油醚（沸程30～60 ℃） 北京长海化工厂；氨水（分析纯） 上海化学试剂有限公司；吐温20、吐温40、吐温60、吐温-80、司盘60、司盘80、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化铝、三氯化铁（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；单甘酯、蔗糖酯（均为分析纯） 成都西亚试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DJM50L实验型胶体磨 上海东华高压均质机厂；HP-60-60型高压均质机 上海科学技术大学机电厂；YC-015实验型喷雾干燥器 上海雅程仪器设备有限公司；Lambda 25紫外-可见分光光度计 美国珀金埃尔默仪器有限公司；DDS-11C电导率仪 上海精科有限公司；DM1000显微镜 德国Leica公司；BZY-1型全自动表面张力仪 上海衡平仪器仪表厂；Mastersizer 2000粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；DelsaNano C Zeta电位仪 美国Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 乳状液制备

将壁材（m（OSAS）∶m（麦芽糊精）＝2∶3）与水混合，40 ℃水浴搅拌10 min。加入体积分数20%的DHA微藻油，加入不同配比的乳化剂（研究金属离子对乳状液稳定性的影响时加入不同价态金属离子），设定总固形物质量分数为25%左右（研究pH值对乳状液稳定性的影响时调节pH值至4～9），在40 ℃水浴中继续搅拌5 min后取出。立即将预乳液倒入胶体磨中研磨2 min后取出，倒入高压均质机中进行两步均质，压力分别为30 MPa和5 MPa，均质完成后得到乳状液。

1.3.2 乳状液稳定性的测定

1.3.2.1 透射光浊度法测定乳状液稳定性

在时间/外力作用下，乳状液液滴体积发生变化，光的透过率也会随之发生变化，可以此来衡量乳状液的稳定性。采用0.2 mol/L的重铬酸钾溶液作为参照，利用紫外-可见分光光度计在固定波长处，选取已制备的乳状液，测定其透光率t的变化来确定乳状液的稳定性，则乳状液稳定性指数（emulsion stability index，ESIt）如公式（1）所示。ESIt越低，乳状液稳定性越强。

式中：t0为初始透光率；t为结束时的透光率。

1.3.2.2 电导率法测定乳状液稳定性

在25 ℃下，利用电导率仪测定乳状液始末的电导率κ。则ESIκ如公式（2）所示。ESIκ越低，乳状液稳定性越强。

式中：κ0为初始电导率；κ为结束时的电导率。

1.3.3 界面膜强度的测定

通过单滴破裂率衡量界面膜强度[20]。在水平的油-水界面上，滴入50 滴乳状液液滴。在85 ℃恒温水浴中，用微量注射器滴1 滴破乳剂溶液，通过公式（3）计算单滴破裂率，以此表征界面膜强度。

式中：Nt为时间60 s内液滴破裂数。

1.3.4 表面张力的测定

量取10 mL乳状液，在室温条件下，放置于表面张力仪的玻璃皿中，仪器自动读取数值即为乳状液表面张力。

1.3.5 粒径和Zeta电位的测定

将制备所得的乳状液稀释1 000 倍，测定粒径和Zeta电位。室温下采用粒度仪进行粒径测定，设定相关参数如下：折射指数为1.47，分散剂的折射指数为1.333，吸光度为0.001。采用Zeta电位仪测定Zeta电位，测定温度为25 ℃，上样体积为1 mL。

1.3.6 微胶囊的制备

利用喷雾干燥方式制备DHA微藻油微胶囊产品，设定过程中进风温度180 ℃、出风温度（80±5）℃、风机频率65 Hz，将制备完成的乳状液雾化干燥，得到微胶囊产品。

1.3.7 油脂过氧化值的测定

准确称取10 g微胶囊样品置于500 mL具塞三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，搅拌溶解；加入50 mL无水乙醇、30 mL乙醚以及30 mL石油醚，振荡2 min，转入分液漏斗，静置分层；取下层液体，用20 mL石油醚萃取2 次，合并滤液，转移至已恒质量的250 mL圆底烧瓶中；使用旋转蒸发仪45 ℃下蒸干，所得即为微胶囊中的油脂。

参考GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》。将上述破壁提取的油脂置于250 mL碘瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰醋酸（2∶3，V/V）混合液，使得样品完全溶解；加入1 mL饱和碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖并轻轻振摇0.5 min，然后在暗处放置3 min；取出后加入100 mL水，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液（1 mol/L）滴定，至淡黄色时，加1 mL淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失；在同样条件下用水和硫代硫酸钠标准滴定溶液做空白实验，样品过氧化值（peroxide value，POV）按式（4）计算。

式中：V1为样品消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积/mL；V2为试剂空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积/m L；c为硫代硫酸钠标准滴定溶液的浓度/（mol/L）；0.126 9为与1.00 mL硫代硫酸钠标准滴定溶液（c（Na2S2O3）＝1.000 mol/L）相当的碘的质量/g；100为换算系数。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2013软件处理分析数据，采用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 乳化剂对乳状液稳定性的影响

2.1.1 HLB值的影响

选择司盘80（HLB值＝4.3）和吐温60（HLB值＝14.9）两种乳化剂进行复配，按不同体积比混合，计算HLB值，因HLB值过高或过低均不易形成稳定乳状液，故控制所得乳状液的HLB值在8～14之间。复配比例及混合后的HLB值如表1所示。

表1 乳化剂复配条件及其HLB值Table 1 Condition of mixed emulsifiers of Span 80 and Tween 60 and their HLB values

将上述复配的乳化剂添加到水相使其充分溶胀，制备乳状液，采用透射光浊度法、电导率法分别衡量乳状液的稳定性，乳状液体系的稳定性与HLB值的关系如图1所示。

HLB值是选择乳化剂的重要标准，能够反映乳化剂分子中亲水基团与亲油基团之间的相对含量。HLB值较高和较低的乳化剂混合使用能够通过界面的定向吸附有效地防止乳状液的絮凝，从而增加乳状液的稳定性。

未添加任何乳化剂的乳状液ESIt为24.6%，同司盘80与吐温60复配后HLB值约为8.0时的乳化剂基本相同（图1）。采用ESIt和ESIκ两种方式衡量乳状液的稳定性，结果表明，HLB值对乳状液的稳定性有明显的影响。随着HLB值的提高，乳状液的稳定性呈现先升高后降低的趋势。当司盘80与吐温60复配后的乳化剂HLB值为11.19时，乳状液ESIt低至6.44%，ESIκ为9.40%，乳化剂的乳化效果最好，体系最稳定。

图1 不同HLB值乳化剂复配对乳状液稳定性的影响Fig.1 Effect of 12 mixed emulsifiers of Span 80 and Tween 60 on emulsion stability

2.1.2 乳化剂类型和比例的影响

以2.1.1节结果为基础，选择日常生产中比较常用的高HLB值乳化剂（吐温20、吐温40、吐温60和吐温-80）和低HLB值乳化剂（司盘60、司盘80、单甘酯和蔗糖酯）进行两两复配，选出HLB值为11.19的组合，每种乳化剂的配比如表2所示。制备乳状液，测定其稳定性参数值，结果如图2所示。

表2 HLB值为11.19时乳化剂复配体积比Table 2 Different combinations of emulsifiers with HLB value of 11.19

图2 HLB值为11.9条件下不同乳化剂复配类型对乳状液稳定性的影响Fig.2 Effects of emulsifier combinations with HLB value of 11.19 on emulsion stability

对照结果显示，未添加任何乳化剂乳状液的ESIt为24.6%。由图2可以看出，与未添加乳化剂的体系相比，ESIt和ESIκ都较低，添加复配乳化剂的乳状液稳定性明显提高。此外，虽然各乳化剂复配后得到相同的HLB值（11.19），但是其对乳状液稳定性的影响明显不同。以透射光浊度法为衡量标准，吐温20与蔗糖酯复配后的乳状液ESIt（14.1%）约是吐温20与单甘酯复配后乳状液ESIt（4.3%）的3 倍。可见，相比于乳化剂的HLB值，乳化剂的类型对乳状液稳定性的影响更明显。

由图2可知，不管选用何种类型的高HLB值乳化剂（吐温20、吐温40、吐温60和吐温-80），复配后所得乳状液ESIt和ESIκ的分布范围较为广泛，证明高HLB值乳化剂的类型对乳状液稳定性影响较小。而与单甘酯复配的乳化剂体系的ESIt均低于6%，ESIκ均低于7%，证明单甘酯的乳化效果最佳，其中吐温20与单甘酯复配后，ESIt为4.3%，所制备得到的乳状液最为稳定。

为探究产生这种现象的机理，选择吐温20与4 种低HLB值乳化剂复配，及吐温40与单甘酯复配进行乳状液的制备，测定乳状液的表面张力和界面膜强度（以单滴破裂率表征），结果如图3所示。

图3 乳化剂复配类型对乳状液稳定性、表面张力和单滴破裂率的影响Fig.3 Effect of selected emulsifier combinations on emulsion stability,surface tension and breaking rate of single droplets

由图3可知，不同的乳化剂复配类型下，表面张力和界面膜强度均明显不同。乳状液的稳定性与表面张力随复配类型的变化趋势有所不同，证明乳状液稳定性与表面张力的相关性较低，表明表面张力对乳状液稳定性的影响程度较小，这可能是表面张力的改变与聚合物在液-液界面上的聚集速度与时间无关所致[21]。乳状液稳定性和界面膜强度（单滴破裂率）紧密相关。乳状液中的液滴可能因频繁相互碰撞而破裂，因此，液滴的机械强度是影响乳状液稳定性的决定因素[22-23]。乳化剂的结构和性质明显影响液滴的界面膜强度。由图3可知，吐温20与单甘酯复配后制备所得的乳状液单滴破裂率最低，表明液滴界面膜强度较高。这可能由于单甘酯的长链结构有助于其与吐温20之间通过侧向相互作用形成较为紧密的分子复合物，促进其吸附于界面层，并形成较为紧密的排列，因此制备所得的乳状液界面膜强度和稳定性较高[24]。

2.1.3 乳化剂添加量的影响

乳化剂添加量与其吸附量密切相关，从而能够影响乳状液稳定性。以不同添加量（占乳状液总体积的比例）的吐温20与单甘酯复配乳化剂为研究对象，对制备所得乳状液稳定性和界面膜强度的影响结果分别见图4、5。

图4 乳化剂添加量对乳状液稳定性的影响Fig.4 Effect of emulsifier concentration on emulsion stability

图5 乳化剂添加量对单滴破裂率的影响Fig.5 Effect of emulsifier concentration on breaking rate of single droplets

由图4可知，乳状液的稳定性随着乳化剂添加量的增加而得到明显提高。这是因为乳化剂添加量较低时，在界面上吸附的分子较少，膜中分子排列松散，界面膜的强度较低（单滴破裂率较高）[25]。如图5所示，乳化剂添加量0.2%时的单滴破裂率为48.0%，因此会形成不稳定的乳状液；当乳化剂添加量增加至1.2%后，体系的ESI逐渐稳定；继续添加乳化剂对乳状液稳定性基本没有影响。这是由于当乳化剂添加量增加到一定程度后，乳化剂分子定向吸附于界面上，在界面上的吸附量达到饱和，且形成紧密排列的高强度界面膜（如图5所示，乳化剂添加量为1.2%时，单滴破裂率为31.3%），因此，乳状液稳定性较高[25]。但是，乳化剂添加量过高会导致乳状液黏度提高，成本增加。合适的乳化剂添加量对于DHA微胶囊的生产有重要意义[26]。综合以上分析，可选择1.2%作为后续研究中乳化剂的添加量。

2.2 乳状液pH值和金属离子对乳状液稳定性的影响

2.2.1 乳状液pH值对乳液稳定性的影响

乳状液制备过程中，水相溶解混匀过程中调节体系的pH值至4～9。测定乳状液的稳定性，结果见图6。

图6 pH值对乳状液稳定性的影响Fig.6 Effect of pH on emulsion stability

由图6可见，随着pH值不断增加，体系的ESI不断下降，乳状液的稳定性越来越高。当pH值大于7时，乳状液的稳定性基本保持不变。为探究造成这种现象的原因，在乳状液制备过程中，调节体系的pH值至4～8，测定体系中pH值变化对乳状液Zeta电位和粒径的影响，结果分别如图7、8所示。

图7 不同pH值条件下乳状液Zeta电位Fig.7 Effect of pH on zeta potential of emulsions

图8 不同pH值条件下乳状液粒径分布Fig.8 Effect of pH on particle size distribution of emulsions

由图7可见，当乳状液的pH值为4时，Zeta电位为4.3 mV，体系带正电。因OSAS含有的羧基阴离子可以使油滴表面带负电荷，所以在pH值为4时，油滴之间容易因静电引力发生聚集，造成油滴粒径较大。由图8可知，在pH值为4时粒径分布于10～100 μm之间的油滴最多。随着pH值的增大，Zeta电位降低，当pH值为5时，Zeta电位为-5.1 mV，体系开始带负电荷。OSAS产生的来自于羧基的阴离子可以使油滴表面带负电荷，通过增加排斥作用减少油滴聚结[27]，粒径明显降低。由图8可见，pH值为5时，粒径分布于10～100 μm之间的油滴数量明显降低，在1～10 μm之间的油滴数量提高。当pH值大于7时，乳状液体系的Zeta电位分别为-21.12 mV（pH 7）和-24.01 mV（pH 8），体系带负电荷较多；体系中粒径分布于1～10 μm之间的油滴数量明显提高，证明其乳状液内的油滴粒子较少发生聚集，乳状液的稳定性较高。由此可见，pH值改变造成的乳状液稳定性变化是由体系电荷变化所引起的油滴聚结或分散所致。

2.2.2 金属离子对乳状液稳定性的影响

在乳状液制备过程中加入的金属离子可能影响乳状液稳定性。选择不同价态的金属离子添加至乳状液中（离子添加量为所占乳状液质量的比例），探究金属离子添加对乳状液稳定性的影响，结果如图9所示。

图9 金属离子对乳状液稳定性的影响Fig.9 Effects of metal ions on emulsion stability

由图9可见，除Fe3+外，一价（Na+、K+）、二价（Ca2+、Mg2+）以及三价（Al3+）金属离子对乳状液稳定性的影响趋势基本一致。随着离子添加量的增加，ESIt呈现先降低后升高的趋势，表明低浓度的金属离子能够促进乳状液稳定性提高。这是由于在乳状液中，颗粒之间存在着一定的能垒，能垒与电解质浓度相关[28]。一定量的金属离子可以加深能垒，防止乳状液发生絮凝，从而形成开放的网状结构，减少分层沉降[29]。当金属离子达到一定量后，离子浓度的增加会造成乳状液稳定性逐渐降低。较高的金属离子添加量会减少乳液体系的电动电荷，降低颗粒/液滴间的表面电势，导致絮凝和聚结，所以当离子添加量达到一定后，ESI均上升，乳状液的稳定性下降。

此外，与低价金属离子相比，高价离子造成乳状液稳定性降低的临界浓度较低，表明高价离子更容易破坏乳状液。其主要原因是高价金属离子可以通过破坏界面膜、减少静电斥力、增强疏水性、压缩油-水基团扩散双电层等方式破坏DHA乳状液体系，造成其稳定性下降[30-31]。

与其他离子均不同，即使Fe3+添加量较低，仍能够明显降低乳状液的稳定性。这是由于Fe3+不仅能够通过破坏界面膜等机制作用于乳状液，而且能够通过促进DHA氧化破坏乳状液的稳定性[32]。

图10 Fe3+对DHA微藻油的氧化作用Fig.10 Oxidation effect of Fe3+ on DHA-rich microalgal oil

由图10可见，乳状液制备过程中加入0.1%的Fe3+，制得的微胶囊在放置1 5 d 后，D H A 微藻油的P O V为4.66 g/100 g，比不加任何金属离子的乳状液POV（2.89 g/100 g）高61%，说明Fe3+对DHA微藻油有较强的氧化作用。当Fe3+的添加量提升至5%以上时，乳状液的界面膜、油-水基团扩散双电层被破坏，加之DHA油脂被氧化溢出，导致OSAS包裹的DHA油脂颗粒之间发生溶胀，水合作用不断加强。乳状液可能会遭到彻底破坏，宏观表现为不溶性悬浊状态（图11）。

图11 加入高浓度Fe3+后乳状液状态Fig.11 Appearance of emulsion added with high concentration of Fe3+

3 结 论

乳状液的稳定性对于DHA微藻油微胶囊产品的品质和货架期有很大影响。对乳状液稳定性影响因素进行深入研究有助于提高DHA微胶囊的品质，促进其在食品领域的广泛应用。本实验研究了微藻油DHA乳状液制备过程中的影响因素，并对其机制进行了分析。结果发现，乳状液制备过程中，乳化剂的添加能够有效促进乳状液稳定性的提高。相比于复配乳化剂的HLB值，乳化剂的类型对稳定性的影响更为明显，这与在乳状液制备过程中不同的乳化剂形成不同强度的界面膜有关。复配乳化剂添加量越多，形成的界面膜强度越高，乳状液稳定性越强。乳状液的pH值和金属离子均能明显影响其稳定性。提高乳状液的pH值能够促进乳状液通过静电斥力等作用避免颗粒之间的碰撞，从而形成粒径较小的乳状液，促进其稳定性的提高。随着金属离子添加量提高，乳状液稳定性呈现先提高后降低的趋势；而且高价离子对乳状液的稳定性影响更为明显。Fe3+能够氧化DHA微藻油，明显降低乳状液的稳定性。本研究对于有针对性地提高DHA微藻油乳状液稳定性和开发高质量微胶囊具有一定的指导意义。