澳洲坚果开花相关MiMADS-box基因克隆及表达载体构建

谭秋锦 张 涛 韦媛荣 郑树芳 汤秀华 王文林

（广西南亚热带农业科学研究所，龙州 532400）

澳洲坚果（Macadamia integrifolia）起源于澳大利亚是一种果仁含有丰富的营养物质的果树，果仁既可以生吃，也可以烘烤，或者作为各种加工食品的成分，特别是糖果产品［1］。澳洲坚果的果壳、油粕经加工成产品后可提高其经济附加值［2］。我国澳洲坚果主要种植在广西、云南等地域，由于其丰富的营养及特殊的口感深受消费者喜爱。我国澳洲坚果品种主要是引进国外高品质品种。在我国栽培驯化和品种选育期间，国外澳洲坚果品种需要调动体内复合调控机制的相关基因应对湿度和温度等环境变化。由于目前国际、国内市场上澳洲坚果处于供不应求的情况，研究其产量相关基因的结构与功能为阐明开花机制打下基础进而为澳洲坚果育种工作者提供理论指导。

MADS-box基因家族是一个家族成员均存在MADS-box 结构域的转录因子家族。在真菌、动物和植物中发现的MADS 家族在N 端有一个高度保守的DNA 结合域，名为MADS。MADS-box基因已经在许多不同的植物物种中被发现。在植物中，MADS-box主要分为I型（SRF-like MADS-box）和Ⅱ型（MEF2-like MADS-box），其中Ⅱ型具有典型的MADS、I、K、C 结构域，也被称为MIKC 型基因［3］。MADS 区域包含一个高度保守的区域，大约有60个氨基酸，MADS区域专门与DNA结合［4］。Ⅰ区由30～35 个氨基酸组成，含有较多的亲水性残基，具有DNA 特异性结合的功能［5］。K 区由65～70 个氨基酸组成，介导蛋白质之间的相互作用。C区由约30 个疏水性氨基酸组成［6］。根据MADS-box基因编码的K-domain 结构域的长度和系统进化分析，可将MIKC 型基因分为MIKCC和MIKC*两类［7～8］。在开花植物中，研究表明MADS-box基因具有广泛的功能，参与花的形成（包括生殖结构的发育），开花时间的调控和营养生长的调控。拟南芥开花时间受三个基因通路的控制。MADS-box基因FLOWERING LOCUS C（FLC）负调控从营养阶段到生殖阶段的过程；CONSTANS（CO）基因调控光周期途径并在长日光的条件下促进开花；赤霉素途径依赖于植物激素赤霉素通过激活分生组织特性基因LEAFY（LFY）传递信号［3］。TCP和MADS-Box转录因子调控非洲菊异型花型识别［9］。在核桃和拟南芥中，MADS-box基因AGAMOUS-LIKE12 的过表达激活了根的发育［10］。BcAP3是一个MADSbox基因，它控制着小白菜的雄蕊发育和雄性不育［11］。OsMADS18 是一种膜结合MADS-box 转录因子，它调节水稻株型和脱落酸的响应［12］。MADS-box基因家族成员在拟南芥、水稻等模式植物中研究较为深入，然而澳洲坚果相关研究甚少。本研究从“桂热1号”品种的叶片中克隆MADS-box基因，利用生物信息学对其结构和功能进行分析并构建亚细胞定位载体pGREEN-MiMADS-box。研究MADS-box基因家族成员的结构与功能为阐明澳洲坚果开花机制打下基础，对促进产业发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料“桂热1号”和“695”品种由广西南亚热带农业科学研究所澳洲坚果种质圃（E106.79.84，N22.14.34）提供。农杆菌GV3101 菌株、大肠杆菌（E.coil）DH5-α感受态、反转录试剂盒购自Takara公司，Phanta高保真酶、ClonEXpress Ⅱ试剂盒、第二代TOPO克隆试剂盒均购自南京诺唯赞公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取总RNA和cDNA的合成

澳洲坚果RNA 的提取、反转录及浓度测定参考王文林的方法［13］。将提取的RNA及反转录获得的cDNA，配制1%琼脂糖凝胶并进行电泳检测。

1.2.2 克隆MADS-box基因全长

根据澳洲坚果转录组序列，利用primer primer6.0 软件设计引物MiMADS-box F，5′-TTCGTTCGTTTCAGGTTTCAG-3′，MiMADS-box R，5′-TCTCATCAGAGCCGCTTCC-3′，引物序列由公司合成。以澳洲坚果“桂热1 号”品种正常叶片的cDNA 为模板，按照高保真酶试剂盒说明书，利用PCR 扩增Mi MiMADS-box的全长序列，将目的条带按照胶回收试剂盒进行回收纯化，目的片段连接PCE2 TA/Blunt-Zero 载体，室温反应5 分钟，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，经PCR 检测后挑取阳性克隆测序。

1.2.3 MADS-box亚细胞定位载体构建

通过CD designV1.04 软件设计带酶切位点插入片段的同源重组引物MiMADS-box-ORFHindⅢ-F，5′-gtcgacggtatcgataagcttATGGGAAGAGGTCCGGTTCA-3′，MiMADS-box-ORRBamH Ⅰ-R，5′-tttactcatactagtggatccTTCCCGTGACAGCATCCAA-3′。以PCE2 TA/Blunt-Zero-MiMADS-box 的质粒为模板利用PCR克隆目标插入片段。利用内切酶HindⅢ、BamHⅠ对绿色荧光融合表达载体pGREEN 改造载体进行双酶切并胶回收，按照ClonEXpress Ⅱ试剂盒说明书进行连接，利用含卡那霉素的培养基筛选并测序检测。

1.2.4 MiMADS-box生物信息学分析

参照樊松乐的方法对MiMADS-box-ORF 进行生物信息学预测分析［14］。利用DNAMAN 工具软件进行多序列比对。MEGAX 构建系统进化树（neighbor-joining，bootstrap 值设为1000）。用于系统进化分析的蛋白序列从PlantTFDB、NCBI下载。

2 结果与分析

2.1 MiMADS-box基因克隆

以澳洲坚果“桂热1 号”品种叶片的cDNA 为模板，采用PCR 扩增MiMADS-box，结果如图1A 所示，扩增出了与预期大小相符的特异性条带。测序验证后，将cDNA 序列命名为MiMADS-box。Mi‐MADS-box基因的cDNA 全长序列1 180 bp，包含729的开放阅读框（ORF），编码242个氨基酸。

2.2 MiMADS-box蛋白质的理化性质预测

ProtParam 工具在线分析MiMADS-box 氨基酸编码蛋白质的理化性质：分子式C1212H1971N363O378S10，总原子数3 934，分子量为27 996.79 Da，等电点9.22，总平均亲水性为-0.917，带正电残基总数（Arg+Lys）为38，带负电荷残基总数（Asp+Glu）为31，不稳定系数为57.39（该蛋白属于不稳定蛋白），脂肪族氨基酸指数是76.94，推测MiMADSbox蛋白是一个不稳定的亲水蛋白。

2.3 MiMADS-box蛋白质的磷酸化位点、跨膜结构及亚细胞定位预测

NetPhos 3.1 在线分析工具预测MiMADS-box蛋白磷酸化位点，结果表明，MiMADS-box 氨基酸序列可能发生磷酸化的位点共有21 个，丝氨酸磷酸化位点14，苏氨酸磷酸化位点6 个，酪氨酸磷酸位点1 个。利用TMPred 在线工具分析预测表明MiMADS-box 蛋白无跨膜结构。SignalP-5.0 Server分析预测MiMADS-box 存在信号肽的概率为0.04%。PlantmPLoc2 预测分析MiMADS-box 蛋白定位于细胞核中。综上MiMADS-box 编码一个非分泌型且无跨膜结构的转录因子蛋白。

2.4 MiMADS-box 蛋白质保守结构域、二级结构、三级结构分析

NCBI 保守结构域工具分析预测表明Mi-MADS-box 蛋白存在MADS superfamily 和K-box superfamily 结构域，其位置分别位于2-79 和83-167，推测其属于Ⅱ型（MEF2-like MADS-box）也称为MIKC 型基因（见图2A）。利用SOPMA 分析Mi-MADS-box 蛋白的二级结构，结果显示α 螺旋占51.65%，延长链占10.33%，β折叠占4.55%，无规卷曲占33.47（见图2B）。利用PHYRE分析MiMADSbox的三级结构如图3C所示。

2.5 MiMADS-box系统进化分析

如图4所示，澳洲坚果MiMADS-box与大豆Gm-CAULIFLOWER A（Glycine max，XP_003547792.1、拟 南 芥AtMADS-box（Arabidopsis thaliana，NP_177074.1）、荷花NnCAULIFLOWER A（Nelumbo nu‐cifera，XP_010260844.1）、黄 花 假 烟 堇PlFRUITFULL（Pseudofumaria lutea，AGX01535.1）和碎米蕨叶 黄 堇CcFRUITFULL（Corydalis cheilanthifolia，AGX01538.1）进行同源性分析，相似性分别为68.18%，61.24%，72.80%，75%和71.83%。多序列比对分析并根据图3A 分析的结果标注MiMADSbox 保守结构域（见图2A）。利用TBtools 中的MEME工具分析澳洲坚果MiMADS-box与其在NCBI 数据库中比对亲缘性较高的MIMADS-BOX 蛋白序列，预测了排名前三的motif（见图3B）。系统进化分析澳洲坚果MiMADS-box 与76 个拟南芥MICK 型 家 族 成 员，MiMADS-box 与AT1G69120.1（AGL7/AP1） 、AT1G26310.1 （AGL10/CAL1） 、AT5G60910.1（AGL8/FUL）、AT3G30260.1（AGL79）亲 缘 关 系 较 近，AT1G69120.1（AGL7/AP1）、AT1G26310.1 （AGL10/CAL1） 、 AT5G60910.1（AGL8/FUL）、AT3G30260.1（AHL79）属于拟南芥MIKCC型的FUL-AP1 亚族成员（见图4），推测Mi-MADS-box 与FUL-AP1 亚族成员具有相似的功能［15～16］。

2.6 MiMADS-box基因组织表达模式分析

“桂热1号”和“695”品种澳洲坚果不同组织枝条、花、和叶片转录组数据表明MiMADS-box基因在“桂热1号”品种的叶片中表达最高，花中的表达量较低，叶片中MiMADS-box基因表达量是花的21倍左右；“695”品种中，MiMADS-box主要在花中表达最高，花中的表达量是叶片的12.5 倍左右。“桂热1 号”和“695”品种同一组织MiMADS-box基因的表达在花和叶片中相差较大，特别是其在花中的表达量“695”是“桂热1 号”的30 倍左右（见图5）。

2.7 MADS-box亚细胞定位载体构建

利用PCR 克隆目标插入片段MiMADS-box-ORF，扩增出了特异性目标条带（见图1B）。利用内切酶HindⅢ、BamHⅠ对绿色荧光融合表达载体pGREEN 改造载体进行线性化。利用同源重组的方法构建了pGREEN-MiMADS-box-ORF-GFP融合表达载体，并利用pGREEN 鉴定引物35S：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′和MiMADS-box-ORRBamHⅠ-R，5′-tttactcatactagtggatccTTCCCGTGACAGCATCCAA-3′，并挑取阳性克隆送测序（见图6）。选择测序正确的阳性克隆进行电击转化农杆菌GV3101，保存菌种。

3 讨论

澳洲坚果是澳大利亚东部亚热带雨林特有的一种坚果作物，在澳大利亚、南非、夏威夷、巴西、中国和其他国家都有种植。澳洲坚果是无性繁殖的，不同品种之间需要异花传粉［17］。不同的澳洲坚果品种的杂交花粉会造成澳洲坚果的核质量、果仁质量、壳质量和核回收率的差异［18］。澳洲坚果的全球产量约为10 万吨（果仁），其中86%来自五个最大的生产国，包括澳大利亚（32%）、南非（30%）、肯尼亚（12%）、美国（8%）和马拉维（4%）［19］。在国内和国际市场上整体上处于供不应求的状态。分子育种在植物遗传改良中扮演着重要的角色，不但能缩短育种周期，还可产生较大的经济、生态效益。基因克隆、载体构建、结构与功能分析是分子育种的基础。

本研究从澳洲坚果“桂热1 号”的叶片克隆了MiMADS-box基因，推导的氨基酸序列为729 bp ORF，编码242 个氨基酸。生物信息学分析发现，MiMADS-box 存 在MADS superfamily 和K-box superfamily结构域，推测属于澳洲坚果MIKCC型基因家族成员。MiMADS-box 定位于细胞核是一个无信号肽、无跨膜结构的不稳定亲水蛋白。

澳洲坚果MiMADS-box 与大豆GmCAULIFLOWER A 拟南芥AtMADS-box、荷花NnCAULIFLOWER A、黄花假烟堇PlFRUITFULL 和碎米蕨叶黄堇CcFRUITFULL 同源性较高。系统进化分析证明MiMADS-box 与AGL7/AP1、AGL10/CAL1、AGL8/FUL、AGL79 亲 缘 关 系 较 近，AGL7/AP1、AGL10/CAL1、AGL8/FUL、AGL79 属 于 拟 南 芥MIKCC型的FUL-AP1（SQUA）亚族成员［20］。从图5可知，“桂热1 号”中，MiMADS-box在花中的表达量最低，“695”中花中的表达量最高。MADS-box基因控制植物的多种生物过程，包括营养生长和生殖发育，主要在花序、花和果实的发育过程中起关键作用。随后，构建pGREEN-MiMADS-box-ORF-GFP 融合表达载体转化农杆菌GV3101 以期利用亚细胞定位技术证明MiMADS-box 转录因子定位于细胞核及利用遗传转化技术转化烟草进行基因功能验证。在拟南芥中，MIKCc基因家族被分为13个分支。在水稻中也发现了FLC分支以外的所有分支的代表。在拟南芥中，有6个属于FLC分支的基因参与了春化和自主途径的开花控制［21］。矮牵牛AP1/SQUA 亚家族的4 个成员对于花序分生组织的特性是必需的［22］。Chen 等构建大豆AP1同源基因GmAP1 亚细胞载体，实验表明定位于细胞核。利用遗传转化技术获得突变体植株进行功能验证，结果表明GmAP1 调控大豆花期和株高［23］。荷花NnAP1在控制花分生组织的特性和花器官的形成中起着重要的作用［24］。拟南芥AGL8基因在花序分生组织中表达，并受APETALA1 负调 控［25］。其 他 植 物AGL9/SEP 蛋 白 相 比，Gm-MADS28 调控花器官数量、花丝长度和花粉释放［26］。SPL10 可 直 接 与AGL79启 动 子 结 合，miR156/SPL10通过调控AGL79（定位于细胞核）在植物侧根生长中发挥作用［27］。在转基因拟南芥中，黄瓜（Cucumis sativusL.）的APETALA1-like基因过表达可诱导其提早开花和叶片发育异常［28］。BpAP1过表达转基因白桦叶片和雄花序中这7 条基因（BpAP1、BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1和LFY）的表达量在不同发育时期均显著高于NT（野生型）和BpAP1抑制表达转基因白桦［29］。李爽等人构建了prokⅡ-PsnAP1-1 过表达载体转化农杆菌并侵染烟草，结果表明转基因烟草比野生型提早开花［30］。王企等人对核桃FRUITFULL（Jr‐FUL）基因进行了克隆、生物信息学及荧光定量PCR 实验，结果表明JrFUL 参与核桃开花中，可能对雄花的开放有促进作用［31］。综上，推测Mi-MADS-box 参与调控澳洲坚果开花及花器官发育的过程，笔者成功的构建了该基因的植物表达载体，为深入研究其调控机制打下坚实基础。