UV-B辐射对84K杨酚酸类化合物积累及其生理生化的影响

盖庆岩 王紫莹 付玉杰 焦 骄 王慧梅 鹿 瑶 刘 婧 富锦先 徐晓杰 姚 兰

（东北林业大学化学化工与资源利用学院，森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040）

杨树（Populusspp.）隶属杨柳科（Salicaceae），为多年生木本植物，是全球分布最为广泛也是适应性最强的树种之一。因其生长快速、便于繁殖及抗逆性强等特点，在我国的绿化树木中占比很大［1］，被认定为木本植物研究中的新型模式植物之一［2］。此外，杨树具有较高的纤维素含量和木质素含量，是制浆造纸、锯材、木质复合板、包装箱、集装箱、人造板工业、火柴杆和筷子的原材料［3］。因此对于杨树的研究，蕴含着巨大的经济价值。84K杨（银白杨×腺毛杨）是韩国选育的一个白杨派无性系杂种。春季没有飞絮的环保型白杨派雄性无性系84K 杨的推广，是加速防护林建设、平原绿化、西部大开发中退耕还林与改善生态的有力保障。同时由于84K 杨生长速度快，出芽率高，繁殖方便等特点逐渐成为抗性研究的典型模式植物之一。

众所周知，植物体在应对外界生物和非生物胁迫时会产生防御性次生代谢产物，它可保护植物体抵御昆虫、病原微生物、干旱/水涝、高温/低温、食草动物等不利因素的伤害。因此，防御性次生代谢产物对植物体的生长发育、繁殖、材性积累等具有重要的作用［4～5］。已有研究表明杨树在虫害［6］、干旱［7］、低温［8］等环境胁迫下可促使酚酸类次生代谢产物含量增加，包括阿魏酸、咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、异阿魏酸等化合物［9］。因此，研究逆境胁迫下，杨树中的酚酸类次生代谢产物含量的变化规律及相关生理响应机制对其生长发育和材性积累具有重要的理论指导价值。

太阳辐射波长在150～400 nm，其中波长较短的为紫外光区，紫外线（UV）根据波长可以分为UV-A（320～400 nm）、UV-B（280～320 nm）和UV-C（200～280 nm）。UV-A 和UV-C 辐射对地球生物影响不大，地球上空的臭氧层也能够阻挡对生物体有害的UV-B 辐射［10］。近年来，随着工业社会的迅速发展，环境污染日趋严重，臭氧层遭到了严重破坏，致使到达地球表面的UV-B 辐射逐渐增强。过量的UV-B 辐射对植物体的影响主要体现在产生过量的ROS致使植物光合作用受损等，但UV-B 辐射可使植物体内防御性次生代谢产物（如黄酮、多酚、木酯素、生物碱、皂苷、硫代葡萄糖苷等）积累得到增强［11～14］，此外抗氧化酶也可以消除由UV-B辐射而产生的过量ROS，以此保护植物体免受UVB辐射对其造成的伤害。众所周知，植物体内酚酸类化合物具备清除ROS 的能力，而杨树中的防御性次生代谢产物是酚酸类化合物。因此，对于UV-B 辐射胁迫下，杨树中防御性酚酸类次生代谢产物的变化情况及相关生理响应机制非常值得探索研究。

基于上述，本研究选用生长迅速、适应性强的84K 杨组培苗为实验材料，对其在不同UV-B 辐射时间下酚酸类化合物、光合色素、氧化产物和抗氧化酶的含量变化进行监测，以期初步明晰杨树在抵御UV-B 辐射下的次生代谢调控及相关生理响应机制，为杨树在抗逆性培育、材性积累等方面提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

84K 杨组培苗由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室提供，其继代及生根培养基为1/2 MS+0.01 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA，置于温度25±2°C、光照强度2 000 Lx、光周期16 h·d-1的环境下进行培养。

1.2 84K杨组培苗的UV-B辐射处理

选取在上述培养条件下生长30 天、生长状态良好且一致的84K 杨组培苗，放置于UV-B 灯下进行辐射处理（辐射强度控制在3 W·m-2），在不同时间点（0、0.5、1、2、4、6、8、12、16 和24 h）取样，样品经自来水冲洗后，一部分迅速置于液氮中速冻，-80°C条件下保存，用于后续光合色素和ROS相关指标的测定；剩余部分样品置于鼓风干燥箱中，在45°C 条件干燥至恒重，用于后续酚酸类化合物的提取和检测。因为受组培苗实验材料所限，每个时间点我们采集了3 株84K 杨组培苗作为后续各项指标的检测材料，且每个实验重复3次。

1.3 酚酸类化合物的提取和检测

6种酚酸类化合物标准品（阿魏酸、咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸和异阿魏酸）均购自维克奇生物科技有限公司。分别精确称取一定质量的酚酸标准品溶解在甲醇（UPLC-MS级）中制成母液。用甲醇对标准品母液进行不同程度的稀释，配置成一系列浓度的标准品溶液。所有标准品溶液经0.22 μm 微孔滤膜过滤后储存在棕色进样瓶中，并置于-20°C 条件下保存。将上述干燥的84K杨组培苗用研钵充分粉碎，精确称取0.1 g 样品并加入2 mL 40%乙醇溶液，放置于超声机中在40°C条件下提取60 min，静置冷却后8 000 r·min-1离心3 min 取上清溶液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤2 次后，保存于棕色进样瓶中待测。

使用安捷伦1290超高效液相色谱仪串联安捷伦6460 四极杆MS 检测器对所有待测样品进行分析检测。色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 柱，柱温30°C；流速为0.4 mL·min-1，进样量为1 μL。流动相由水（A）和乙腈（B）组成，梯度洗脱程序为：0～3 min，90%～75% A；3～3.1 min，75%～25%A；3.1～4.5 min，25%A；4.5～5 min，25%～90%A。质谱条件为：毛细管电压3.5 KV（ESI-），干燥气温度350°C，气流10 L·min-1，雾化器电压50 psi，加速电压为4 V。在多反应监测模式下对6 个目标酚酸类化合物进行定性和定量分析，各目标化合物监测离子对分别为：阿魏酸（m/z193.1→134.1）、咖啡酸（m/z179.0→135.1）、没食子酸（m/z169.0→125.0）、原儿茶酸（m/z153.0→109.0）、绿原酸（m/z353.1→191.1）和异阿魏酸（m/z193.1→178.0）。由上述系列已知浓度的标准品溶液在上述检测条件下，绘制每个目标化合物的标准曲线，样品中目标化合物含量由标准曲线进行换算测定。

1.4 光合色素含量的提取和检测

精确称取上述冷冻的84K 杨组培苗叶片样品0.05 g，将其置于研钵中，加入液氮充分研磨后转移到离心管中并加入5 mL提取溶液（丙酮∶95%乙醇=1∶1）中提取12 h。光合色素采用吸光光度法测定，具体条件如下：叶绿素A（Chl A）在663 nm波长下测定；叶绿素B（Chl B）在645 nm 波长下测定；类胡萝卜素（Car）在480 nm 波长下测定；总叶绿素含量Chl为Chl A和Chl B含量的总和［15］。

1.5 氧化产物含量的提取和检测

本项研究中，84K 杨组培苗中氧化产物（过氧化氢、超氧阴离子与丙二醛）含量是通过苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒进行测定，具体测定方法如下：

过氧化氢（H2O2）首先按照植物鲜重（g，FW）：提取液体积（mL）为1∶10 的比例进行冰浴匀浆后转移至EP 管中用试剂定容至1 mL。在8 000 r·min-1，4℃条件下离心10 min 后取上清溶液置于冰上待测，随后将测定管与对照管中依次加入一定剂量的提取剂与样本混匀下室温静置5 min 后倒入比色皿中，测定415 nm处吸光值A。计算△A=A测定-A对照；

超氧阴离子（OFR）首先按照植物鲜重（g，FW）：提取液体积（mL）为1∶10 的比例进行冰浴匀浆后在10 000 r·min-1，4°C 条件下离心20 min后取上清溶液置于冰上待测，随后将测定管与空白管中依次加入一定剂量的提取剂与样本混匀后，在8 000 r·min-1，25°C条件下离心5 min后倒入比色皿中，测定530 nm处吸光值A。计算△A=A测定-A空白；

丙二醛（MDA）首先按照植物鲜重（g，FW）：提取液体积（mL）为1∶10 的比例进行冰浴匀浆后在8 000 g，4°C 条件下离心10 min，取上清溶液置于冰上待测。吸取0.6 mL 试剂盒试剂于1.5 mL 离心管中，再加入0.2 mL 样本混匀。在95°C 水浴中保温30 min 后置于冰上冷却，随后在10 000 g，25°C条件下离心10 min。吸取上清液于1 mL倒入比色皿中，测定532 和600 nm 处的吸光值，记为A532和A600，计算△A=A532-A600。

1.6 抗氧化酶活性检测

本项研究中，84K 杨组培苗中抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶）是通过苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒进行测定，具体测定方法如下：

超氧化物歧化酶（SOD）首先按照植物鲜重（g，FW）：提取液体积（mL）为1∶10 的比例进行冰浴匀浆后在8 000 r·min-1，4°C 条件下离心10 min取上清置于冰上待测，随后将测定管与对照管中依次加入一定剂量的提取剂与样本混匀下室温静置30 min 后倒入比色皿中，测定450 nm 处吸光值A；

过氧化物酶（POD）首先按照植物鲜重（g，FW）：提取液体积（mL）为1∶10 的比例进行冰浴匀浆后在8 000 r·min-1，4°C 条件下离心10 min 取上清置于冰上待测，随后在比色皿中加入50 μL样本和950 μL 工作液混匀，记录470 nm 下1 min 时吸光值A1和2 min时的吸光值A2。计算△A=A2-A1；

过氧化氢酶（CAT）首先按照植物鲜重（g，FW）：提取液体积（mL）为1∶10 的比例进行冰浴匀浆后在8 000 r·min-1，4°C 条件下离心10 min 取上清置于冰上待测，随后将测定管与对照管中依次加入一定剂量的提取剂与样本，混匀后取1 mL 溶液于比色皿中，测定405 nm处吸光值A。计算△A=A对照-A测定。

1.7 数据处理

试验所得数据使用Origin 2018 软件进行作图。运用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析。实验结果差异性显著分析是通过单变量方差分析（ANOVO）结合邓肯检验在P＜0.05 的显著水平上实现的。

2 结果与分析

2.1 UV-B 辐射对84K 杨组培苗中酚酸类化合物含量的影响

已有研究表明，杨树中防御性次生代谢产物为酚酸类化合物，具体包括阿魏酸、咖啡酸、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、异阿魏酸等［9］。据此，我们对UV-B 辐射胁迫下这6 种目标酚酸类化合物的含量变化进行研究。在本项研究中，UV-B 辐射设定为一个温和的强度3 W·m-2（有利于触发植物次生防御代谢反应），不同UV-B 辐射时长下84K杨组培苗中6 种目标酚酸类化合物含量采用UPLC-MS/MS 进行定性和定量分析（如1.3 中所述）。实验结果如图1 所示，在UV-B 辐射胁迫下，84K 杨组培苗中除没食子酸外的5 种酚酸化合物含量均有所增加，且总体呈先下降而后逐渐上升最终再下降的趋势，其中在12～16 h 期间积累量最高，尤其是绿原酸含量增加幅度最大（15倍左右）。整体而言，适当的UV-B 辐射可以增加84K 杨组培苗中的酚酸类化合物的积累。

2.2 UV-B 辐射对84K 杨组培苗叶片中光合色素含量的影响

已有研究表明，UV-B 辐射对植物体生长发育的直接影响在于其会干扰植物体内叶绿体系统，改变叶绿素和类胡萝卜素的含量，进而影响植物体的光合作用［16］。因此，我们需要对UV-B 辐射下84K 杨组培苗叶片中叶绿素和类胡萝卜素的含量变化进行研究。植物叶片的表型是显示植物光合色素是否受影响的最直观方式。如图2 所示，UVB辐射在16 h前对84K杨组培苗叶片无明显伤害，在24 h时出现轻微灼烧现象。如图3A～C 所示，随着UV-B 辐射处理时间的增加，叶绿素A、叶绿素B和总叶绿素含量除0.5 h 外较辐射前均有所提高。在0.5 h 时，84K 杨组培苗叶片中叶绿素A、叶绿素B 和总叶绿素含量均低于对照，这体现了UV-B 辐射胁迫对植物体的瞬时伤害效应。在16 h时，84K杨组培苗叶片中叶绿素含量达到了最高值，可能是因为组培苗中酚酸类化合物有效防护了UV-B辐射对植物体产生的伤害，从而保护甚至增强了84K 杨组培苗中光合色素的合成和积累，酚酸类化合物含量变化与叶绿素含量变化趋势相一致说明了这一点。此外，类胡萝卜素与酚酸类化合物含量变化趋势也相一致（见图3D）。类胡萝卜素是一种抗氧化剂，在生物膜上、电子吸收和传递过程中起着重要作用，有保护叶绿素的作用。同时，类胡萝卜素中具有的共轭双键，能够吸收紫外线，可有效减弱其对光合色素的破坏［17］。作为叶绿素的保护色素，类胡萝卜素和酚酸类化合物一样，在应对UV-B 辐射对于84K 杨组培苗伤害方面具有相同的防御性作用。因此，其含量变化与酚酸类化合物含量变化较为一致。

2.3 UV-B 辐射对84K 杨组培苗中氧化产物含量和抗氧化酶活性的影响

UV-B 辐射是通过诱使植物体内产生过量的ROS 而对细胞内核酸、蛋白质等生物大分子和膜系统产生伤害［18］。我们推测UV-B 辐射胁迫对上述酚酸类化合物和光合色素含量的影响可能与ROS 的产生有关，因此，我们对ROS 系统中的典型指标包括氧化产物含量（H2O2、MDA 和OFR）和抗氧化酶活性（SOD、POD 和CAT）进行测定。以此来验证UV-B 辐射下ROS 的产生情况。作为生物体内最常见的活性氧分子，UV-B 辐射下84K 杨组培苗中H2O2、MDA 和OFR 含量变化如图4A～C 所示，随着UV-B 辐射时长的增加，所有氧化产物指标的含量在不同时间点下均高于辐射前，表明UV-B 辐射促进了84K 杨组培苗中ROS 的过量产生。此外，作为生物体内活性氧分子的清除酶，UV-B 辐射胁迫下84K 杨组培苗中SOD、POD 和CAT 活性变化如图4F 所示，随着UV-B 辐射时长的增加，除CAT外，SOD和POD活性出现了不同程度的变化，尤其是POD活性在UV-B辐射处理下活性显著增强，这也体现了84K 杨组培苗应对UV-B辐射所引起的ROS伤害的积极防御反应。

3 讨论

本项研究结果表明除没食子酸外，5种目标酚酸类化合物含量在UV-B 辐射下大多数时间均呈上升趋势，很明显UV-B 辐射促进了84K 杨中防御性酚酸类化合物的合成和积累。刘景玲等［19］对丹参进行不同时长的UV-B 辐射，发现丹参中咖啡酸等酚酸化合物随着胁迫时间的增加整体含量呈上升趋势。党悦方等［20］发现低剂量的UV-B 辐射可以促进夏枯草中总酚含量升高。这些研究均与本项研究结果较为一致。通常情况下，UV-B 辐射会导致植物细胞内产生过量的ROS，一方面ROS 可对植物细胞大分子和生物膜造成伤害［21］，可直接触发抗氧化酶系统活性用以清除过量的ROS；另一方面ROS 可作为重要的信号分子，触发细胞内产生一系列生理生化反应，最终激活具有抗氧化活性的防御性次生代谢产物生物合成酶基因表达上调从而使其含量升高，用以清除过量的ROS，维持细胞内氧化还原水平的平衡。本项研究中，84K杨组培苗中酚酸类化合物含量随着UV-B 辐射增加总体呈上升趋势可归因于这类化合物所具有的抗氧化活性，可清除UV-B 辐射胁迫所导致的过量ROS。此外，植物体内的酚酸类物质被报道具有吸收紫外光的特点［22］，因此目标酚酸类化合物含量上升的结果也可能是因为84K 杨组培苗为了应对持续增加的UV-B 辐射，通过不断合成该类化合物用以减弱UV-B 对植物体的伤害。同时，在本研究中观察到了酚酸类化合物含量在UV-B 辐射胁迫的前期和后期呈降低趋势，这可能是因为在辐射的前期植物体无法对胁迫进行及时的防御响应，辐射的后期由于UV-B 辐射剂量过大，超过84K 杨组培苗的耐受极限，对其体内防御系统产生了不可逆的伤害，从而导致酚酸类化合物含量出现了降低（如图2 叶片在24 h 时出现了灼伤现象）。

叶绿素是绿色植物进行光合作用所需最重要的色素，同时它也是衡量植物体对UV-B 辐射耐受性的重要生理指标之一［23］。本研究结果表明，光合色素随UV-B 辐射的增加总体呈上升趋势。张娟等［24］对豌豆芽苗菜进行不同程度的UV-B 辐射，发现其叶绿素含量随着UV-B 辐射胁迫强度的增加呈上升趋势。褚润等［25］对芦苇进行不同程度的UV-B 辐射胁迫，发现低强度的UV-B 辐射对叶绿素的合成和积累有促进作用。韩雯等［26］对拟南芥进行不同程度的UV-B 辐射，发现适宜强度UV-B辐射可使叶绿素的含量得到增强。这些研究均与本项研究结果较为一致。本项研究中，随着UV-B辐射时长的增加，一方面84K 杨组培苗中酚酸化合物含量的持续增加，有利于清除体内ROS 从而保护了叶绿素的合成不受影响；另一方面，植物在UV-B（非白光）照射下，为了保持其正常的光合作用，将会增强叶绿素的合成。基于上述两个原因，84K 杨组培苗叶片中叶绿素的含量在UV-B 辐射下呈现了不仅未受影响反而得到增强的结果。此外，我们发现了光合保护素类胡萝卜素的含量变化与防御性酚酸类化合物含量变化趋势较为一致，这是因为类胡萝卜素可以减弱UV-B 对光合电子转移链的破坏［27］，并且还可以吸收过量光能来保护叶绿素不被氧化［28］从而抵御UV-B 辐射对光合色素的伤害。

众所周知，植物在正常生长环境下，其体内的活性氧将维持在一个稳定的水平，当其受到逆境胁迫时，植物体内会大量积累活性氧，将会打破细胞内氧化还原平衡。进而引起生物大分子聚合以及膜脂过氧化，破坏细胞的正常结构与生理功能［29］。在植物受到氧化损伤时，体内的酶促防御系统（抗氧化酶）与非酶促防御系统（非酶类抗氧化物质）将协同清除细胞内的活性氧自由基。在本实验中随着UV-B 辐射的增强，84K 杨组培苗中H2O2、MDA 和OFR 含量均在不同时间出现了增高现象。

崔晓晓等［30］发现UV-B 辐射会增加怀地黄中氧化产物的含量。周璇等［31］发现UV-B 辐射会增加沙棘幼苗中氧化产物的含量。董开升［32］等发现UV-B 辐射会增加孔石莼、鼠尾藻中氧化产物的含量，同时酚酸类化合物与抗氧化酶含量皆有不同程度的响应变化。本项研究中，84K 杨组培苗中氧化产物含量的升高表明了UV-B 辐射胁迫确实触发了ROS 的过量产生。同时，抗氧化酚酸类化合物含量的整体增加与抗氧化酶（特别是POD）活性的增强展现了84K 杨组培苗的酶促防御系统与非酶促防御系统对于ROS 的协同清除现象，也是对UV-B辐射所引起的氧化应激的典型防御反应。

4 结论

本项研究结果发现在温和的辐射强度下（3 W·m-2），适当的UV-B 胁迫处理（12～16 h）有利于84K 杨组培苗中除没食子酸外的5 种目标酚酸类化合物（阿魏酸、咖啡酸、原儿茶酸、绿原酸和异阿魏酸）的合成和积累。同时，防御性酚酸类次生代谢产物和类胡萝卜素可对叶绿素形成有效保护，对其在UV-B 辐射下的合成和积累产生了积极的影响（含量整体呈现上升趋势）。研究还发现UVB 辐射确实触发了84K 杨组培苗中ROS 的过量产生，抗氧化酚酸类化合物与抗氧化酶（特别是POD）对ROS 的清除展示出了协同效果，体现了植物体对UV-B 辐射胁迫所引起的氧化应激的典型防御反应。总体而言，本项研究初步明晰了杨树在抵御UV-B 辐射下的次生代谢调控及相关生理响应机制，为未来杨树的抗逆性培育方面提供了一定的理论依据。