基于DNA条形码的柳属植物系统发育研究

任伟超 徐 姣 孙 伟 刘美琦 于欣欣 王思嘉 马 伟*

（1. 黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学佳木斯学院，佳木斯 154007；3. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700）

近年来，DNA 条形码技术已被陆续应用于木本植物及相应木材的种质鉴定，在目标基因选择、DNA 提取及生物信息学分析等方面均取得显著进展［1］。植物DNA 条形码的研究主要集中于叶绿体基因组和核基因组。叶绿体片段（matK、rbcL 和psbA-trnH）和核基因片段（ITS）已广泛应用于高等植物DNA 条形码研究中［2～10］。目前关于柳属植物的DNA 条形码技术分析的相关研究较少。刘明航［11］对垂柳、曲枝垂柳、龙爪柳的ITS 序列进行扩增及测序分析，结果表明曲枝垂柳、龙爪柳、垂柳、旱柳差异是种内变异水平，应为一个种。该结论与传统柳属的分类存在明显的不同。王东超［12］对32 种柳属进行测序，结果支持将钻天柳归入柳属当中且与大白柳为一支。准葛尔柳与本组另外两种亲缘关系远，可以单独分支，建议四子柳和纤序柳合并为一个种，建议紫柳组分为两个类群。

DNA 条形码技术是以染色体组为基础，用一段标准DNA 序列作为标记实现快速、准确和自动化的物种鉴定方法［13］，具有以下优点［14～15］：①由于具有稳定的遗传信息，不受检测样本形态变化的影响。②对在形态学上相近的物种进行物种鉴定。③建立数据库完善遗传信息，弥补传统分类对物种形态描述的不足。该技术已广泛应用于动植物物种鉴定、中药材混伪品鉴定、进出口检验检疫、食品安全检测等。林业方面利用DNA 条形码技术对木材种类进行监管，同时还能规范木材贸易市场和保护珍贵濒危树种。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选取黑龙江省分布的柳属植物，样本采自于伊春、哈尔滨、大庆、塔河，共计11 个物种40份样本。所有凭证标本保留在黑龙江中医药大学药学院。具体采集地、海拔及经纬度信息见表1。本研究采用新鲜、成熟、健康的柳属叶片作为提取DNA的实验材料。将样本置于其中40℃中烘干24 h。本研究引用的序列Genbank 登陆号与其对应的物种名见表2。

表2 研究引用GenBank中的序列Table 2 The GenBank sequences used in study

1.2 基因组DNA提取

取植物样本约50 mg 加入液氮充分碾磨。向粉末中加入700 μL DNA裂解液，56℃水浴2 h。采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。

1.3 PCR扩增与测序

ITS2 通 用 引 物S2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' 和S3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反应条件为94℃，5 min；（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s）40 个循环；72℃，10 min。psbA-trnH 引 物PA：5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3' 和 TH： 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。反应条件为94℃，4 min；（94℃，50 s；58℃，50 s；72℃，50 s）40个循环；72℃，7 min。扩增体系均为25 μL，DNA 模板2 μL，正反向引物各1 μL，MIX 8.5 μL，ddH2O 12.5 μL，扩增产物置于4℃保存。在1.0%琼脂凝胶中，每份DNA 样本点样5 μL，电源电压设置为120 V，电泳时长30 min。将胶置于凝胶成像系统检测，结果是ITS2 序列PCR 产物约在500 bp 处出现目的条带，阴性对照无条带。选取有条带的PCR产物进行双向测序。

1.4 数据分析

利用CodonCode Aligner V 3.7.1 软件，将正反两个方向测序峰图进行校对拼接获得完整序列。针对ITS2序列，需要去除引物区和低质量区，对序列进行注释。去除5.8 S 和28 S 区段，获得ITS2 间隔区序列；针对psbA-trnH 序列，校对拼接后去除引物区和低质量区。然后将所有序列用MEGA7.0软件进行分析比对，以Kimura2-parameter（K2-P）为遗传距离模型，计算并比较各序列种间、种内遗传距离，用邻接法构建系统聚类树，利用bootstrap（1 000次重复）检验各个分支的支持率［16］。

2 结果与分析

2.1 上传新型ITS2序列至NCBI数据库

本研究中共向NCBI 数据库中提交12 个物种共计40 条ITS2 序列，包括钻天柳3 条；柳属37 条，其中白皮柳（MT177150）、圆头柳（MH924219，MT177162）、乌柳（MH924218）、筐柳（MT177181，MT177182）和 卷 边 柳（MT177183，MT177184，MT177185，MT177186）共计10 条ITS2 序列为首次提交至NCBI 数据库。具体40 条ITS2 序列信息见表3。

表3 上传至GenBank的柳属、钻天柳ITS2序列注册编号Table 3 The numbers of ITS2 sequences date of Salix，Chosenia arbutifolia uploaded to GenBank

2.2 柳属与钻天柳、山杨的种间遗传距离分析

针对能够准确鉴定的5个物种进行种间、种内遗传距离分析。筐柳种内遗传距离为0；与其它4种的种间遗传距离最小为0.009 3，与其它4 种的种间遗传距离最大为0.090 1。钻天柳种内遗传距离为0；与其它4种的种间遗传距离最小为0.009 3，与其它4 种的种间遗传距离最大为0.084 4。粉枝柳种内最大遗传距离为0.004 6，其种内平均遗传距离为0.001 0；与其它4 种的种间遗传距离最小为0.009 3，与其它4 种的种间遗传距离最大为0.089 8。五蕊柳种内遗传距离为0；与其它4 种的种间遗传距离最小为0.014 1，与其它4 种的种间遗传距离最大为0.095 6。山杨种内遗传距离为0，与其它4 个种的种间遗传距离最小为0.084 4，最大为0.095 6。由于以上5 个物种种内最大遗传距离数值小于与其他物种种间最小遗传距离数值，故用ITS2 序列能够对筐柳、钻天柳、粉枝柳、五蕊柳、山杨进行准确鉴定（见表4）。

表4 柳属、钻天柳及山杨种内及种间遗传距离Table 4 The interspecific genetic distance and genetic distance between Salix，C.arbutifolia and P.davidiana

2.3 基于ITS2 序列的柳属、钻天柳和山杨NJ 树鉴别

基于各物种ITS2 序列构建Neighbor-Joining（NJ）树（见图1）：五蕊柳能聚为一支，支持率为67%；粉枝柳能聚为一支，支持率为63%；筐柳能聚为一支，支持率为66%；蒿柳能聚为一支，支持率为64%；以上4种柳属可明显的与其他物种互相区分开。而卷边柳同属蒿柳组，不能自聚为一支，仅能鉴定到蒿柳组级别，支持率为62%；旱柳、朝鲜柳、白皮柳、圆头柳同属柳组，同样不能各自聚为一支，仅能鉴定到组级别，支持率为90%。另外钻天柳能聚为一支，支持率在64%，与柳属中五蕊柳、粉枝柳遗传距离较近。因此基于ITS2 序列的DNA 条形码鉴定方法能将五蕊柳、粉枝柳、筐柳、蒿柳与其他物种区分开，柳组物种仅可鉴定到组级别。

2.4 基于psbA-trnH 序列的柳属系统发育树鉴别

对从40 份DNA 样本进行psbA-trnH 序列的扩增，有35 份样本扩增成功，扩增成功率为87.5%。采用MEGA7.0 软件NJ 法，对扩增成功的35 份样本psbA-trnH 序列构建系统发育树，得到系统聚类（见图2），在以psbA-trnH 基因片段序列建立的系统发育树中，不同物种不能各自独立聚为一支。

3 讨论

柳属植物具有重要的经济价值。广泛应用于园林绿化、制作手工艺品、防风固沙等方面。在形态学上，由于柳属植物雌雄异株、先花后叶、分布范围广、对环境适应性强、不同种之间受人为或自然杂交因素的影响，都使得柳属植物在物种鉴定上存在难度。因此，柳属植物的形态学鉴定及分子鉴定一直是广大科研工作者专注研究的课题。

本研究以柳属和钻天柳、山杨为研究对象。探索叶绿体基因（psbA序列）和核基因（ITS2序列）在柳属植物鉴定方面的应用。在扩增效率方面，ITS2 的扩增效率为100%，而psbA-trnH 的扩增效率为87.5%。在物种鉴定方面，ITS2序列可将五蕊柳、粉枝柳、筐柳、蒿柳与其他物种区分开，柳组物种可鉴定到组级别。同时，由于信息位点少，两大群内部形成许多小的分支后验概率偏低，内部的系统发生关系仍没有得到解决。ITS2 序列系统发育树显示，钻天柳（钻天柳属）与柳属植物的亲缘关系极为接近，本研究结果可作为把钻天柳归为柳属的分子学依据。在由psbA-trnH 序列建立的系统发育树中，柳属各物种的聚类较为混乱。这是由于柳属不同组的各物种，它们拥有相同的叶绿体单倍型，此现象可能与柳属的特殊种群进化方式有关，例如杂交和选择性捕获［17］。该差异造成了核基因片段（ITS2）和叶绿体片段（psbA-trnH）对物种鉴定效果的差异。赵奉彬［18］利用核基因组片段在杨属的区分上具有较好效果，而叶绿体片段并不能得到很好结果。本研究得到相似结论即核基因片段在柳属的区分上比叶绿体片的分辨率好，而叶绿体片段的柳属分辨率远远低于核基因组片段。psbA-trnH 序列对柳属植物的分子鉴定效果不理想，与之相比较ITS2 序列在柳属植物分类鉴定上具有一定的优势。

对ITS2可准确鉴定的物种旱柳、朝鲜柳、圆头柳、粉枝柳结合地理分布信息进行分析。研究发现，旱柳、朝鲜柳、圆头柳均采自于伊春、哈尔滨、大庆，这三地地理纬度接近，而粉枝柳采自伊春和塔河且两地的地理纬度相差近5 个纬度；在ITS2系统发育树中也有所体现，采自伊春的粉枝柳样本聚为一支，采自塔河的样本独立于伊春样本聚为另一支。结果表明不同地理居群在种内进化存在地域性，但由于样本数较少影响了鉴定的准确性，在后期研究中可扩大取样范围和取样数量。

通过对收集到的各物种样本形态学观察，同时结合ITS2序列构建的系统发育树。柳组各物种叶片的形态基本一致，这与ITS2 序列仅能鉴定到柳组级别的结果相一致。其它可运用ITS2准确鉴定的物种，其叶片性状与其他物种均存在差异。这表明，对叶片的形态学鉴定和运用ITS2 序列鉴定结果基本一致。本研究证明基于ITS2 序列的DNA 条形码技术对杨柳科的鉴定有效，建议杨柳科的分子学鉴定方法可采用以核基因组片段（ITS或ITS2）单独或组合形式的DNA条形码鉴定。