超声辅助提取红花中主要活性成分的工艺优化

李 钰 杨 晓 叶 霄 邓洁琼 黄位年 代 沙

（1. 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，成都 610300；2. 四川省攀枝花市农林科学研究院，攀枝花 617000）

红花（Carthamus tinctoriusL.）是菊科（Compositae）红花属（Carthamus）的一种蓟状自花授粉1 年生二倍体（2n=24）草本植物，该属约25 种，我国仅有红花一种。我国红花种植面积约3.5 万公顷，年产量约4 000 吨，主要分布于新疆伊犁和塔城区域。其干燥花为《中国药典》（2020版）收录的红花药材，传统用药以红花干燥花瓣入药。红花的主要活性成分较多，已分离并报道的包含黄酮类物质、生物碱、脂肪酸、聚炔等200 多种化合物［1～2］。干燥花瓣主要活性成分为黄酮类化合物，包括查耳酮类化合物、山奈酚和槲皮素为基本母核的一系列衍生物、芦丁、木犀草素等化合物［3］。

查耳酮类多为色素类成分，其中红花黄色素是多种水溶性成分的混合物，通过进一步分离，1993 年首次分离得到羟基红花黄色素A。羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）为药典规定的质量指标性成分，研究较为广泛，医学上主要集中于冠心病、脑血栓等血液循环疾病的治疗及抗肿瘤、抗心脑血管病变和抗诱变等方面［4～6］。姜华、盛雨辰等人研究表明HSYA 可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，在脑缺血性损伤动物模型中，HSYA 具有明显的治疗、防御和神经保护功能，可以显著减少脑组织坏死面积，改善动物行为缺陷，预防缺血性脑梗塞［7～9］。同时，HSYA 还是一种应用较广的天然食用色素，可用于各种糕点、糖果、清凉饮料各类食品和化妆品的高端着色剂，具有很高的实用价值。山萘酚衍生物山奈酚-3-O-芸香糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷可抑制疼痛和水肿，具有镇静和抗炎的作用［10］。槲皮素及其苷类有抗炎、抗病毒、抗肿瘤的作用。木犀草素具有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌等多种药理活性［11］。

红花中黄酮类生物合成途径普遍认为其为复合型代谢路径，分别经草莽酸途径和乙酸—丙二酸途径，由一个桂皮酰辅酶A和三个丙二酰辅酶A在查耳酮合成酶（CHS）的作用下生成查耳酮，再在相关酶的作用下转化形成黄酮、异黄酮、花青素苷等各类黄酮化合物［1，12～14］（见图1）。中药是一个“多功效、多组分”的复杂体系，不同活性物质具有不同的药理活性，不同提取方法会影响提取物的组成和各成份含量，从而影响提取物的功能活性。目前红花黄酮类成分提取方法有水提法、微波辅助提取法、超声辅助水提法、纤维素酶法提取等，且各学者评价指标中红花黄酮类化合物种类不尽相同，导致提取工艺多样化［3，15～18］。

红花黄酮类主要成分为药典规定成分HSYA，本试验以红花黄酮类及其代谢通路上相关化合物为研究对象，以HPLC测定红花黄酮类主要化合物含量为评价指标，通过单因素试验和响应面分析模型对提取工艺进行建立和优化，以期找到制备红花主要活性提取物的最佳方法和工艺，为红花品种改良及进一步开发利用提供实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红花材料均由四川省农业科学院经济作物研究所提供，采集于成都市青白江区姚渡镇科研基地，于盛花期采摘后40℃烘干粉碎，过5 目药典筛（0.18 mm孔径），密封储存于干燥器中备用。

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）美国Fisher 公司；磷酸（色谱纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；超纯水（Milli-Q 纯水系统）；对照品HSYA（CASNo：78281-02-4，批号：20120816）、山萘酚-3-O-芸香糖苷（CASNo：17650-84-9，批号：20131021）、山萘酚-3-o-葡萄糖苷（CASNo：480-10-4，批号：20130124）；槲 皮 素（CASNo：117-39-5，批 号：20110926）购自上海永恒生物科技有限公司；对照品槲皮素葡萄糖苷（CASNo：482-35-9，批号：PS001041/PS0400-0020）、柚皮素（CASNo：480-41-1，批号：PS001115/PS0240-0025）、柚皮素查耳酮（CASNo：73692-50-9，批号：PS170320-04）、山萘酚（CASNo：520-18-3，批号：PS001201/PS0207-0025）购自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200 高效液相色谱仪，G1314B VWD检测器，Aglilent Chemstation 化学工作站；KQ-250VDB 双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HHS-11-4 恒温水浴锅（上海百典仪器设备有限公司）；T-214 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；GZX-9146MBE 电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.3 方法

1.3.1 提取方式及溶剂的选择

研究考察超声提取和回流提取在不同提取溶剂（70%甲醇、70%酸性甲醇、70%乙醇、70%酸性乙醇）下对红花黄酮类成分含量的影响。材料中黄酮类物质采用HPLC-UV 法测定，用外标法计算含量，重复3 次测定，取平均值。根据试验结果选择适宜的提取方法进行单因素试验。

超声步骤：精密称取0.2 g 材料，加入70%的溶剂25 mL，称重，70℃超声45 min，超声功率250 W，频率45 kHz，超声结束后冷却溶液，冷却后补重至原重，12 000 r·min-1离心3 min，取滤液，即得。

回流步骤：精密称取0.2 g材料，精密加入70%溶剂25 mL 提取溶剂，称重，70℃水浴回流45 min，冷却后加溶剂补重至原重，12 000 r·min-1离心3 min，取滤液，即得。

HPLC 色 谱 条 件：Agilent XDB-C18 色 谱 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），体积流量V=1 mL·min-1，柱 温30℃，进 样 量10 μL，检 测 波 长337 nm（见表1）。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Sequence of gradient elution

1.3.2 提取方法的优化

1.3.2.1 单因素试验设计

采用单因素试验设计，研究考察两种提取方法（超声提取和回流提取）在不同提取溶剂（70%甲醇、70%酸性甲醇、70%乙醇、70%酸性乙醇）下对红花材料黄酮类成分含量的影响。提取后，材料中黄酮类成分采用HPLC-UV法测定。

超声法单因素试验：分别对料液比（0.1∶25、0.2∶25、0.3∶25、0.4∶25、0.5∶25、0.6∶25 g·mL-1）、超声温度（25、40、55、70、85℃）、超声时间（15、30、45、60、75、90 min）、溶剂百分数（0%、10%、30%、50%、70%、100%）、超声功率（40%、60%、80%、100%，Max=250 W）、超声频率（28 kHz、45 kHz）进行单因素考察。

回流法单因素试验：分别对料液比（0.1∶25、0.2∶25、0.3∶25、0.4∶25、0.5∶25、0.6∶25 g·mL-1）、回流温度（40、55、70、85、100℃）、回流时间（15、30、45、60、75、90 min）、溶剂百分数（0%、30%、50%、70%、90%、100%）、溶剂pH（1、2、3、4、5、6.3）进行单因素考察。

1.3.2.2 响应面试验设计

根据单因素试验结果，利用Box-Behnken 试验设计原理，以花瓣中主要黄酮类成分为响应值，以单因素结果所选因素为自变量，建立多因素3 水平试验点的响应面分析试验模型，并利用Design Expert 10.0 对结果进行多元线性回归方程拟合，检验模型，对模型进行响应值预测，优化花瓣中主要黄酮类成分提取工艺条件，并进行验证试验。

1.4 统计分析

所有试验均重复3 次。单因素试验采用SPSS 22.0 软件对数据进行One-Way 方差分析，采用Design Expert 10.0软件对响应面试验结果进行分析。

1.5 优化方法与药典法比较验证

取红花材料分别用本试验优化方法和药典方法进行提取测定，比较不同提取方法中黄酮类成分提取率。

2 结果与分析

2.1 红花提取工艺条件确定结果

2.1.1 红花提取方法和提取溶剂的选择

红花中检测的黄酮类成分指标有HSYA、槲皮素葡萄糖苷、山萘酚-3-O-芸香糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、柚皮素查耳酮、柚皮素、山萘酚；不同提取方法各成分提取率如图2：红花中主要黄酮类成分为HSYA 和山萘酚-3-O-芸香糖苷，两者共同占比85%以上；山萘酚-3-O-葡萄糖苷和槲皮素葡萄糖苷含量较少，各占8%以下；槲皮素、柚皮素查耳酮、柚皮素、山萘酚提取率在1%以下忽略不计。结果显示HSYA 对提取溶剂PH 较为敏感，在酸性提取溶剂条件下，提取率均极显著降低，山萘酚-3-O-芸香糖苷提取率则对PH无显著变化，降低PH 有助于提高槲皮素葡萄糖苷和山萘酚-3-O-葡萄糖苷提取率。针对不同提取溶剂，超声和回流提取效果差异不同。乙醇作溶剂时，超声和回流HSYA 和山萘酚-3-O-芸香糖苷提取率差异不显著。甲醇作溶剂时，超声HSYA 和山萘酚-3-O-芸香糖苷提取率极显著高于回流，因此选择70%甲醇超声作为红花提取黄酮类成分的考察工艺，考察指标以主要成分HSYA 和山萘酚-3-O-芸香糖苷提取率为工艺目标。

2.1.2 单因素试验结果

2.1.2.1 料液比对提取红花黄酮类成分含量的影响

随着料液比增加，HSYA提取率逐渐降低，山奈酚-3-O-芸香糖苷先升高，后降低。0.1∶25和0.2∶25时，HSYA 和山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率变化差异不显著，当增加到0.3∶25 时，HSYA 提取率极显著下降，山奈酚-3-O-芸香糖苷变化不显著，再继续增大到0.4∶25时，山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率极显著下降。因此选择最佳料液比为0.2∶25 g·mL-1。

2.1.2.2 超声温度对提取红花黄酮类成分含量的影响

温度的增加会导致分子间运动加速，渗透和扩散速度加快，从而影响提取率［19］。随着超声温度的增加，HSYA 和山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率变化呈现相同趋势，先无显著变化，40℃后提取率极显著增加，最后趋于平衡。选择考察超声温度为70℃。

2.1.2.3 超声时间对提取红花黄酮类成分含量的影响

超声时间影响溶质溶出量，随着超声时间的增加，HSYA 和山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率变化趋势相似。随超声时间增加，提取率增加，在30 min时达到最大值，随后略有降低，但差异不显著。因此，选择考察超声时间为30 min。

2.1.2.4 甲醇百分数对提取红花黄酮类成分含量的影响

随着提取溶剂甲醇百分数由0 增加到30%，HSYA提取率变化差异不显著，随后继续增加甲醇百分数至50%，HSYA 提取率极显著增加，随后变化差异不大，但若用100%甲醇，因HSYA 为水溶性物质，此时HSYA 提取率会极显著降低。山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率随着甲醇由0%增加到50%，提取率逐步显著提高，随后趋于平衡。因此，选择考察提取溶剂为50%甲醇。

2.1.2.5 超声功率对提取红花黄酮类成分含量的影响

超声仪最大功率为250 W，随着超声功率的增加，HSYA 和山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率变化趋势相似，均为逐渐升高，在80%时达到最大提取率，随后略有降低。但整个过程变化差异均不显著。因此，选择考察超声功率为80%。

2.1.2.6 超声频率对提取红花黄酮类成分含量的影响

超声频率考察试验中，HSYA、山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率均为45 kHz＞28 kHz，但差异不显著。因此，选45 kHz作为超声频率。

2.1.3 红花响应面试验设计和结果

在单因素试验基础上，利用Box-Behnken 试验设计原理，以红花中主要黄酮类成分HSYA 和山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率为响应值，以料液比（X1）、超声温度（X2）、超声时间（X3）、甲醇百分数（X4）、超声功率（X5）5 个因素为自变量，建立5因素3 水平共46 个试验点的响应面分析试验模型，因素水平编码见表2，试验设计和结果见表3。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Experimental factors and levels used in response surface analysis

表3 响应面试验方案与结果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.1.3.1 红花响应面试验数据处理及数值分析

为了研究不同条件对红花主要黄酮类成分HSYA 和山奈酚-3-O-芸香糖苷制备的影响和确定最佳提取条件，在单因素试验的基础上进行中心组合试验（Box-Behnken），对工艺参数进行优化，试验设计方差分析结果见表4～5。

表4 HSYA优化回归模型方差分析Table 4 Analysis of varlance for the content of total HSYA in the extract with various extraction conditions

表5 山奈酚-3-O-芸香糖苷优化回归模型方差分析Table 5 Analysis of varlance for the content of total Kaempferol-3-O-β-rutinoside in the extract with various extraction conditions

以HSYA 为响应值时，模型的F-Value 值为121.43，Lack of Fit 值为2.24，试验模型极显著，失拟项不显著，信噪比37.861，变异系数3.02%，表明数据集中，离散程度小，拟合方程满足响应面分析的要求。此时所得HSYA提取率（Y）对料液比（X1）、超声温度（X2）、超声时间（X3）、甲醇百分数（X4）、超声功率（X5）的二次回归方程为：Y=1.58 167-0.53 720X1-0.00 524 603X3+ 0.021 834X4- 0.00 698 661X5-0.022 143X1X4+0.0 000 964 286X4X5+3.61 310X12+0.000 112 434X32-0.000 250 097X42。模型的校正决定系数R2Adj=0.9601，说明该模型能解释96.01%响应值的变化；决定系数R2=0.9681，说明该模型拟合程度较好，可用于模型分析和预测HSYA 的提取率。根据F值和P值确定影响HSYA 提取的主要因素为甲醇百分数＞料液比＞料液比与甲醇百分比的交互作用＞甲醇百分数与超声功率的交互作用＞超声时间＞超声功率。

以山奈酚-3-O-芸香糖苷为响应值时，对多元回归方程进行方差分析（见表4），此模型虽然失拟项显著，但模型仍呈极显著。变异系数5.77%，离散度减小，R2=0.899 8，调整决定系数RAdj2=0.884 4，信噪比为20.782，表明该模型能解释88.44%山奈酚-3-O-芸香糖苷含量的变化，能在一定程度下对不同提取条件下的山奈酚-3-O-芸香糖苷得率进行预测，模型可用。对回归方程系数进行显著性检验，甲醇百分数（X4）、X42为极显著项，X22这2 项为显著项，表明甲醇百分数对山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率具有极显著影响，但甲醇百分数、超声温度对提取率的影响不是简单的线性关系。此时所得山奈酚-3-O-β-芸香糖苷提取率（Y′）对料液比（X1）、超声温度（X2）、超声时间（X3）、甲醇百分数（X4）、超声功率（X5）的二次回归方程为：X′=-1.65 562+0.036 282X2+0.041 308X4+0.017 893X5-0.000255291X22-0.000348251X42-0.000116518X52。影响山奈酚-3-O-β-芸香糖苷提取的主要因素为溶剂甲醇的百分数。

2.1.3.2 交互作用对红花HSYA 和山奈酚-3-O-芸香糖苷得率的影响

响应面3D 曲面的倾斜度可以确定两因素对响应值的影响程度，倾斜度越高，陡坡越陡，说明两者交互作用越显著，颜色越深。等高线形状也可以直观地反映各因素交互作用对响应值影响的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则不显著，等高线中最小椭圆的中心点即响应面的最高点［20-23］。由表4～5 方差分析可知，料液比与甲醇百分数、超声功率与甲醇百分数对HSYA 提取率的影响存在极显著的交互作用，其他因素间交互作用不显著。在图9～10 中表现为响应曲面坡度相对较陡，等高线比较密或呈椭圆形。交互作用中，甲醇百分数对HSYA 提取率的影响强于料液比，甲醇百分数对HSYA 提取率影响强于超声功率。

2.1.4 优化提取工艺参数的验证

通过Design Expert 10.0 分析预测所得最大响应值：HSYA 提取率1.756%，山奈酚-3-O-β-芸香糖苷提取率1.539%，与之对应的预测工艺条件为：料液比0.1∶25 g·mL-1、超声温度71.091℃、超声时间45 min、甲醇百分比56.806%、超声功率71.087%（Max=250 W）。根据实际操作，对提取工艺进行处理，在料液比0.1∶25 g·mL-1、超声温度70℃、超声时间45 min、甲醇百分比57%、超声功率71%（Max=250 W）的条件下进行验证实验，检测图谱如图11 所示，组份间分离效果好，HSYA 提取率实测值为1.74%，山奈酚-3-O-β-芸香糖苷提取率实测值为1.53%，与预测的理论值相接近，验证了此模型的有效性。

2.2 优化方法与药典法比较验证

由图12 可知，4 个材料中优化后的提取方法HSYA 得率高于药典中的提取方法，山奈酚-3-Oβ-芸香糖苷提取率极限值高于药典提取法，该方法在提取红花中主要黄酮类成分具有一定的优越性，对红花中主要黄酮类成分具有较好的提取性。

3 结论

通过HPLC测定，红花花瓣中主要黄酮类成分为羟基红花黄色素A 和山奈酚-3-O-芸香糖苷，红花中主要黄酮类成分为HSYA 和山萘酚-3-O-芸香糖苷，两者共同占比85%以上。本试验在单因素试验的基础上进行5 因素3 水平46 个试验点的响应面优化，得出影响羟基红花黄色素A 提取率最主要因素为甲醇浓度＞料液比＞料液比与甲醇浓度的交互作用＞甲醇浓度与超声功率的交互作用；影响山奈酚-3-O-β-芸香糖苷提取率最主要因素为甲醇浓度。

红花花瓣主要活性物质最佳提取条件为：料液比0.1∶25 g·mL-1、超声温度70℃、超声时间45 min、溶剂为57%甲醇、超声功率177W，所得羟基红花黄色素A 提取率为1.74%；山奈酚-3-O-芸香糖苷提取率为1.53%。

不同于其他物种，红花中花瓣几乎不含花青素，黄酮类物质主要由醌式查耳酮和黄酮醇组成［12，24］。醌式查耳酮是红花花瓣颜色形成的主要物质，其红色和黄色的染料都来自于醌式查耳酮一类［25～26］。花中主要黄酮类成分HSYA 和山萘酚-3-O-芸香糖苷由同一代谢通路起源，在四羟基查耳酮（tetrahydroxy chalcone）下游分为两条不同代谢支路，分别在相关酶的作用下代谢生成醌式查耳酮和黄酮醇及其糖苷。该方法能较好的提取其代谢通路中的主要活性成分HSYA 和山萘酚-3-O-芸香糖苷，为产品开发、品种改良奠定一定研究基础。