梁山慈竹DfMYB3基因克隆及启动子分析

杜恬恬 李会萍 王博雅 欧 倩 黄 艳 曹 颖 胡尚连，2*

（1. 西南科技大学植物细胞工程实验室，绵阳 621010；2. 四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，绵阳 621010）

MYB转录因子是最重要的植物转录因子大家族之一，参与了植物生长的许多生理过程。第一个从植物中获得的MYB基因是玉米的Clorless1（C1）转录因子［1］，随后在棉花［2］、大豆［3］、拟南芥［4］等植物中的MYB 蛋白也被鉴定出来。MYB 转录因子结构域中包含DNA-Binding结构域，根据结构的不同，可分为1R-MYB、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB 4类蛋白［5］，其中R2R3-MYB 是最大的一类转录因子，广泛参与了植物的生长发育调控［6］、次生壁的形成［7］、初级和次级代谢［8］、胁迫响应以及激素应答［9］等。如棉花R2R3-MYB 转录因子GhMYB7在棉纤维发育中高表达，GhMYB7过表达拟南芥会增加维管和胞间纤维的细胞壁厚度，以及激活次生壁生物合成相关基因的表达，导致纤维素和木质素的异位沉积［10］。拟南芥R2R3-MYB 转录因子AtMYB60在莴苣中抑制会花青素的合成，过表达AtMYB60会导致莴苣花青素的产生和积累受到抑制［11］。麻疯树R2R3-MYB 转录因子JcMYB1经干旱、聚乙二醇、氯化钠和冷处理后表达量均上调，ABA 和茉莉酸处理也可上调JcMYB1的表达，而乙烯不诱导Jc-MYB1的表达，揭示了JcMYB1在响应非生物胁迫中的重要作用［12］。

MYB转录因子在非生物胁迫以及激素应答方面有较多的研究。Chen等通过对拟南芥全基因组的序列分析，在MYB 超家族中鉴定出126 个R2R2-MYB 转录因子，大多数MYB基因能够响应一种或多种激素以及胁迫应答［4］。芥菜BjMYB1-3和BjMYB1-4基因在拟南芥中的过表达表现出种子提前萌发、促进生长以及对渗透胁迫或高盐胁迫的耐受性提高现象［13］。小麦TaMYB1基因在缺磷条件下表达量上调，过表达TaMYB1植株比野生型表现出更多的磷积累，提示TaMYB1在磷饥饿胁迫耐受性方面起关键作用［14］。过表达紫花扁豆R2R3-MYB 转录因子LpMYB1转基因拟南芥可以提高耐盐性和耐旱性，转基因种子的发芽势也有所提高［15］。玉米ZmMYB30基因在脱落酸（ABA）、聚乙二醇（PEG）、NaCl、低温4 种胁迫下表达水平均明显上调，ZmMYB30转基因拟南芥异位表达促进了植物的耐盐性，同时非生物胁迫相关基因的表达量也有所增加，提高了植物的抗逆性［16］。

目前，MYB转录因子在水稻、拟南芥等模式植物和毛竹等散生竹中研究较多，但在梁山慈竹等丛生竹中，MYB 转录因子的研究却鲜见报道。梁山慈竹是我国主要经济竹种之一，广泛分布于四川、云南、贵州、广西等全国各地［17］，是一种优良的笋材两用竹种，具有纤维含量高且质量好，生物量大等特点。本研究基于梁山慈竹转录组数据库，从梁山慈竹叶片中克隆得到一个MYB 转录因子，命名DfMYB3，对其进行了生物信息学分析、亚细胞定位，以及启动子分析，为将来进一步研究梁山慈竹DfMYB3转录因子的功能提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

梁山慈竹生长于西南科技大学生命科学与工程学院植物资源圃，叶片采集后迅速置于液氮中速冻，并于-80℃超低温冰箱中保存。梁山慈竹当年生侧枝条用于激素处理，分别用100 μmol·L-1的赤霉素（GA）、100 μmol·L-1的脱落酸（ABA）对梁山慈竹侧枝条进行处理，以H2O 为对照，喷洒处理5 d，用于检测DfMYB3基因的表达量变化。野生型烟草NC89 无菌苗由本实验室保存，组培室中光照16 h/黑暗8 h生长。

1.2 试剂

RNA 提取试剂盒Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 购自OMEGA 公司，cDNA 反转录试剂盒Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time，Genome Walking Kit 试剂盒以及pMD19-T 载体均购自Ta-KaRa 公司，PCR 扩增试剂盒Q5 High-Fidelity 2X Master Mix购自NEB公司，实时荧光定量PCR试剂盒SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）SuperReal购自天根公司。农杆菌EHA105 菌株，DH5α 大肠杆菌感受态、pART27 载体以及改造过的pBI 载体由本实验室保存。

1.3 方法

1.3.1DfMYB3基因克隆

叶片总RNA 由Omega Bio-Tec Plant RNA Kit试剂盒提取，之后用Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time 反转录试剂盒合成cDNA。用Primer Premier 6.0 软件设计特异性引物DfMYB3-F/R（引物序列见表1）。采用NewEnglandBiolabs（NEB）公司的Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 试剂盒，扩增DfMYB3转录因子。PCR 反应程序为98℃预变性30 s，98℃变性10 s，67℃退火20 s，72℃延伸40 s，30 个循环，72℃延伸2 min。扩增产物与pMD19-T 载体连接，转化DH5α 大肠杆菌，进行蓝白斑筛选。将阳性单菌落菌液送至上海英潍捷基公司进行测序。

1.3.2 DfMYB3生物信息学分析

用NCBI 在线工具Conserved 对DfMYB3 进行保守结构域预测分析。用ProtParam 在线工具对DfMYB3基因编码的蛋白进行分子量、理论等电点、稳定指数、氨基酸个数等理化性质指标的测定。用SOPMA 在线工具对DfMYB3蛋白进行二级结构预测。SWISS-MODE 在线工具对DfMYB3 蛋白进行三级结构预测。以DfMYB3 的氨基酸序列为探针，从国家水稻数据中心、植物转录因子数据库、NCBI三种数据库中获得多条有功能的MYB序列，将氨基酸序列导入MEGA7.0筛选最适模型，采用最大似然法（Maximum Likehood）构建系统进化树（Bootstrap 参数为1000）。用PlantCARE 在线网站对DfMYB3启动子序列进行元件分析。

1.3.3 实时荧光定量PCR

用Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 试剂盒提取GA、ABA 处理后的梁山慈竹侧枝条RNA，用Prime Script®RT reagent Kit prefect real Time 试剂盒反转录成cDNA，并利用Primer Premier6.0 软件设计Df-MYB3基因的qRT-PCR 特异性引物RT-DfMYB3-F/R（引物序列见表1），以Tublin 作为内参基因，Tublin-F/R 引物序列见表1。用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）SuperReal 试剂盒进行qRT-PCR 反应，分析DfMYB3基因的表达量变化情况。采用2-ΔΔCT对DfMYB3基因的相对表达量进行计算，并用Duncan法进行差异显著性分析。

1.3.4 DfMYB3亚细胞定位

用BioEdit 软件分析DfMYB3基因的所有酶切位点，用Primer Premier6.0 软件设计特异性引物DfMYB3-F（KpnⅠ）和DfMYB3-R（HindⅢ）（引物序列见表1），与含有绿色荧光蛋白（GFP）的pART27载体连接。将重组质粒DfMYB3-pART27 转入水稻白化苗原生质体中，以DAPI 细胞核染色作为阳性对照，在激光共聚集显微镜下观察DfMYB3融合GFP蛋白的表达情况。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5DfMYB3启动子克隆

梁山慈竹DfMYB3基因序列通过与毛竹的同源MYB 序列比对，设计3 条同向特异的引物SP1、SP2、SP3（引物序列见表1）。CTAB 法提取梁山慈竹叶片基因组DNA，以基因组DNA 为模板，利用染色体步移法克隆DfMYB3上游启动子序列。Genome Walking Kit 试剂盒中的AP1、AP2、AP3、AP4引物与设计的3 条特异引物SP1、SP2、SP3 进行热不对称PCR反应。3次巢式PCR反应后可获得Df-MYB3基因的侧翼序列。

1.3.6DfMYB3启动子转基因烟草植株的获得及GUS染色

用BioEdit 软件分析DfMYB3启动子的酶切位点，用Primer Premier6.0 软件设计特异性引物pDf-MYB3-F（HindⅢ）和pDfMYB3-R（XbaⅠ）（引物序列见表1），将克隆得到的DfMYB3启动子连接含有GUS报告基因的改良pBI 载体，构建pDfMYB3：：GUS 重组质粒，通过叶盘法转化烟草。提取转基因及野生型烟草植株的DNA，进行PCR阳性验证。阳性转基因烟草苗在GUS染液（1 mL磷酸缓冲液，0.1 mL TritionX-100，0.2 mL K3Fe（CN）6，0.2 mL K4Fe（CN）6，10.4 mg X-Gluc，补水定容至10 mL）中进行组织染色，37℃培养箱放置过夜，然后用卡诺固定液（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1）进行脱色。

2 结果与分析

2.1 DfMYB3基因克隆及生物信息学分析

基于梁山慈竹转录组数据库，以梁山慈竹叶片为材料，克隆得到一个MYB 转录因子，命名为DfMYB3。测序结果显示，DfMYB3基因的开放阅读框长度为1 287 bp（见图1A），编码428 个氨基酸，GenBank 注册号为KY963358。理化性质分析显示，DfMYB3 的分子量为47.33 KD，酸性残基数大于碱性残基数，理论等电点为6.12。稳定指数结果显示，DfMYB3 编码的是不稳定蛋白。Df-MYB3 的脂肪族氨基酸指数为65.00，总亲水性平均系数为-0.644。保守结构域分析显示，DfMYB3含有两个典型的SANT 结构域（见图1B），具有DNA-Binding 结构域。二级结构分析显示，Df-MYB3 蛋白中无规卷曲含量最丰富，为60.51%，其次是31.78%的α-螺旋，β-转角和延伸链含量最少，分别为3.97%和3.74%（见图1C）。蛋白三级结构显示，DfMYB3 蛋白的三维结构与B-MYB DNA结合域蛋白1a5j.1.A模型最为相似（见图1D）。

系统进化树分析显示，DfMYB3 与甘蔗Sc2RMyb1，毛白杨PtoMYB216，拟南芥AtMYB55和AtMYB4，以及水稻OsMYB46 和OsMYB103L 聚集在一起（见图2），同源性较高。这些物种的MYB 序列都属于典型的R2R3-MYB 转录因子［18～19］，而且没有单子叶、双子叶植物的差异。

2.2 DfMYB3亚细胞定位

为了研究DfMYB3蛋白的亚细胞定位情况，构建了DfMYB3 融合绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒DfMYB3-pART27，并转入水稻白化苗原生质体中进行瞬时表达。以DAPI 细胞核染色作为参照，在激光共聚焦显微镜下观察GFP 的表达情况。结果显示，在细胞膜以及细胞核中都检测到了GFP荧光信号（见图3），但在细胞核中更为显著。

2.3 DfMYB3启动子克隆及元件分析

以梁山慈竹基因组DNA 为模板，利用染色体步移法克隆得到DfMYB3上游2 000 bp 左右的5′侧翼序列。PlantCARE在线分析结果表明，该序列上含有启动子元件TATA box、CAAT box，以及2 个脱落酸（ABA）响应元件ABRE、1 个生长素响应元件AuxRR-core，8 个茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件CGTCA-motif 和TGACG-motif，1 个赤霉素（GA）响应元件GARE-motif，1 个水杨酸（SA）响应元件TCA-element，2 个干旱响应元件MBS，以及4 个光响应元件（见表2）。

表2 DfMYB3启动子元件分析Table 2 Element analysis of DfMYB3 promoter

2.4 DfMYB3基因对GA和ABA处理的响应

启动子元件分析发现，DfMYB3启动子序列上存在多个激素响应元件。为探究DfMYB3对GA及ABA 处理的响应情况，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了DfMYB3基因在100 μmol·L-1的GA、100 μmol·L-1的ABA 处理下的表达量变化情况。以水为对照，分别用100 μmol·L-1的GA、100 μmol·L-1的ABA 对梁山慈竹当年生侧枝条进行喷洒处理，5 天后提取侧枝条的RNA 进行qRT-PCR分析。结果显示，GA 及ABA 处理均显著上调了DfMYB3的表达。GA 处理后DfMYB3的表达量是对照的1.6倍，ABA处理后DfMYB3的表达量更高，达到了对照的7.6倍（见图4）。

2.5 DfMYB3启动子的功能分析

为研究DfMYB3启动子的活性，构建了Df-MYB3启动子融合GUS报告基因的pDfMYB3：：GUS 载体。通过叶盘法转化烟草，获得了12 株抗性植株。DfMYB3启动子序列的PCR 分析结果表明，有9株烟草抗性苗扩增出与阳性对照一致的特异性条带，证实pDfMYB3：：GUS 已成功整合到烟草基因组中（见图5）。GUS组织染色结果表明，在转基因烟草叶片的主叶脉和次叶脉中有明显的GUS 信号（见图6A），但在茎杆中GUS 信号较弱（见图6B）。对茎秆进行徒手切片后发现，在茎杆的表皮、皮层、维管组织以及髓细胞中均存在GUS信号（见图6C～D），表明DfMYB3启动子在烟草中没有明显的组织特异性（见图6）。

3 讨论

MYB 转录因子广泛存在于各种植物中，在植物的生长发育过程中起十分重要的作用。本研究克隆得到一个梁山慈竹MYB转录因子，命名为Df-MYB3。进化树分析显示，DfMYB3 与毛白杨、拟南芥等的R2R3-MYB转录因子聚集在一起。MYB 转录因子根据结构域的不同可分为4 类蛋白，其中R2R3-MYB 是最大的一类MYB 蛋白，广泛参与了一系列植物生理过程，包括激素应答［20］、胁迫响应［21］、次生壁形成［22］等。转录因子通常定位在细胞核中［23］，调控下游基因的转录，但也有转录因子同时定位于细胞核以及其他部位，如水稻的ASR蛋白同时定位于细胞核和细胞质中［24］。丹参R2R3-MYB 转录因子SmMYB87 的亚细胞定位研究发现，SmMYB87 蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布［25］。本研究的亚细胞定位结果显示，在细胞核以及细胞膜中均检测到了GFP 信号，表明Df-MYB3蛋白在细胞核以及细胞膜中均有表达，但在细胞核中更为显著。

启动子是能够调控基因表达的顺式作用元件。蓝莓VcMYB启动子转基因拟南芥能驱动GUS基因在拟南芥中表达，并且经ABA、低温和光照处理后，转基因拟南芥中GUS 的表达活性增强［26］。海岛棉MYB 转录因子GbMYB5基因的启动子能够驱动GUS报告基因在拟南芥的根部、叶尖部及生长点表达，推测该启动子是一个组织特异性启动子［27］。启动子元件分析发现，DfMYB3启动子序列上含有启动子元件TATA box 以及CAAT box，具有典型的启动子特征。DfMYB3启动子转基因烟草GUS 组织染色发现，GUS 信号在烟草叶片的叶脉以及茎杆中都被检测到，在叶脉处最为显著，表明DfMYB3启动子具有启动子活性，能够驱动GUS基因的表达，且DfMYB3启动子在烟草中没有明显的组织特异性。

研究表明，小麦R2R3-MYB 转录因子Ta-MYB33，其启动子序列包含ABRE、MYB 等非生物胁迫相关元件，过表达拟南芥增强了干旱和NaCl胁迫的耐受性，并且提高了渗透压平衡重建和活性氧清除能力［21］。甘蔗胁迫相关的MYB 转录因子ScMYBAS1表现出对水分缺失和盐胁迫的诱导反应，对启动子PScMYBAS1的缺失分析表明，777 bp 或更长的启动子片段在非生物胁迫（脱水、盐、冷、伤）和激素（SA、MeJA）处理下，GUS 的诱导率增加了2～4 倍［28］。巴巴多斯棉R2R3-MYB 转录因子GbMYB60受ABA 以及盐等胁迫诱导，GbMYB60转基因拟南芥ABA 相关基因表达量下调，揭示了棉花GbMYB60基因可能通过抑制ABA 信号来负调节植物对盐胁迫的耐受性［29］。烟草R2R3-MYB转录因子NtMYB44b经100 mg·L-1GA、10 μmol·L-1ABA 处理后，相对表达水平显著上调，推测Nt-MYB44b能对上述浓度的GA 及ABA 处理产生应答［30］。金鱼草MYB 转录因子AmDIV的拟南芥同源蛋白AtDIV2参与了ABA 信号传导，在外源ABA胁迫下，AtDIV2的表达水平显著增加［31］。菊花R2R3-MYB 转录因子CmMYB2经外源ABA 处理后，菊花叶中的CmMYB2表达量上调［32］。本研究的qRT-PCR 分析结果显示，DfMYB3基因的相对表达量经GA、ABA 处理后均显著上调，表明DfMYB3基因能对GA 及ABA 处理产生应答。DfMYB3启动子序列上存在MBS 干旱胁迫响应元件等，需要进一步的研究来探讨DfMYB3是否在非生物胁迫中起作用。