食用植物酵素中酵母菌的分离鉴定及耐受性研究

徐成龙，王珍珍，余瞻，王高坚，冯哲校，史文超，沙如意*，毛建卫,2*

1(浙江科技学院 生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江省农业生物资源生化制造协同中心，浙江 杭州, 310023)2(浙江工业职业技术学院，浙江 绍兴, 312000)

食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海藻类、食药两用本草类等食材为原料，经长时间有益菌发酵而产生的功能性微生物发酵产品，具有丰富的活性成分、益生菌及次生代谢产物等。研究表明该类产品不仅具有抗氧化、抗炎的作用，而且具有增强机体免疫能力及抗癌等多种保健功能[1-4]。

酵母菌是一类以芽殖为主的单细胞真核微生物，在自然界分布广泛，主要生活在偏糖和偏酸环境中，广泛应用于发酵工业中。在葡萄酒工业中酿酒酵母的最适pH值通常在3.0～3.6[5]，在酵素发酵过程中其发酵液具有高糖低pH的特点。所以酵母菌耐受性的强弱直接影响到了产品的周期和风味[6]。从自然发酵的酵素产品中分离出酵母菌，研究其在高糖和低pH条件下的耐受性对于研究酵素的发酵机理、功能成分、产品生产、饮料及发酵产品的开发、生产、质量控制等方面具有重要意义。

本研究从茶叶酵素，乌饭树叶酵素，铁皮石斛花酵素，紫苏酵素和火龙果酵素原液中分离出7株酵母菌，通过形态学鉴定、生理生化实验及 26S rDNA 序列分析等，对筛选菌株进行菌种鉴定，通过耐高糖实验和耐低 pH 实验，对分离出菌株的耐受性进行考察，旨在为植物酵素的发酵过程研究、工业化生产提供菌种方面基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵一年半的茶叶酵素、乌饭树叶酵素、铁皮石斛花酵素、火龙果酵素和紫苏酵素原液，由浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室提供。

酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、溴钾酚紫、海藻糖、甘露糖、果糖、棉子糖、可溶性淀粉、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；固蓝B、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaCl，国药集团化学试剂有限公司(上海，中国)；氮源基础培养基和碳源基础培养基，美国BD公司。

MB-150CL恒温恒湿培养箱，青岛明博环保科技有限公司；SW-CJ超净工作台，无锡易纯净化设备有限公司；TS-2102C小型立式恒温摇床，上海天呈实验仪器制造有限公司；SMART光学显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；Allegra X-12R冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；Spectra Max 190酶标仪，美国Molecular Devices公司。

1.2 培养基的配制

YEPD培养基：酵母浸出粉1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，纯水100 mL，pH 6.0，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

糖发酵培养基：蛋白胨1 g，水100 mL，16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液0.2 mL，pH 7.6，20 g 碳源(海藻糖、甘露糖、果糖、棉子糖、可溶性淀粉、半乳糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖)，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

无维生素培养基：葡萄糖2 g，(NH4)2SO40.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，NaCl 0.01 g，加水至100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min[7]。

300、450、600、750、900 g/L高糖培养基的配制：酵母浸粉1 g，蛋白胨2 g，分别加入葡萄糖30、45、60、75、90 g，水定容至100 mL，pH 5.0，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

低pH培养基：酵母浸出粉1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，水100 mL，分别调pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5后，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的分离纯化

吸取茶叶酵素、乌饭树叶酵素、火龙果酵素、紫苏酵素、铁皮石斛花酵素原液，用梯度稀释法稀释后涂布于YEPD培养基上进行培养，用划线分离法将酵母菌分离纯化至单菌落，直至在显微镜下观察到纯菌株为止，将纯化好的菌株于斜面低温冷藏保存。

1.3.2 形态培养特征观察

将单菌落接种到YEPD固体、液体培养基中于28 ℃培养48 h，观察菌落大小、颜色，菌落凹凸程度，菌落的质地，记录菌体所在位置，有无菌醭、沉淀、浑浊，并于光学显微镜1 000倍油镜下观察其菌体形态、形状、繁殖方式并且测量其菌体大小。

1.3.3 生理生化特征鉴定

酵母菌生理生化特征鉴定:依据《酵母菌的特征及鉴定手册》和《微生物学实验手册》设计，主要包括：糖发酵鉴定[8]、碳源同化实验[9]、氮源同化实验[10]、无维生素培养基上的生长实验、耐高渗透压的测试、产生类淀粉化合物测定、单宁分解利用实验[11]、脲酶实验[12]、重氮基蓝B实验[13]等。

1.3.4 分子生物学鉴定

1.3.4.1 26S rDNA 序列测定

在上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.3.4.2 同源性分析与系统发育树的构建

根据测序结果，从https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/[14]中选择DNA数据库进行同源序列搜索(basic local alignment search tool)，匹配得到与供试菌菌株的序列相似的已知菌株的序列。根据同源序列搜索结果，使用bio-edit软件将供试菌序列和已知菌株序列进行多序列对位排列，并采用MEGA 7.0软件中Neighbour-Joining方法[15]构建系统发育树。

1.3.5 耐受性试验

1.3.5.1 高糖耐受性试验

将菌种在液体YEPD培养基中活化12～16 h，制成106CFU/mL的菌悬液，按3%的接种量，分别接种于起始葡萄糖质量浓度为300、450、600、750、900 g/L的YEPD液体培养基中，pH 5.0，于28 ℃，150 r/min 条件下培养5 d，每12 h取1次样，将样品于10 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液，用无菌水重悬沉淀旋涡混匀后测定OD600，每个浓度重复 3 次。

1.3.5.2 低pH耐受性试验

将菌种在液体YEPD培养基中活化12～16 h，制成106CFU/mL的菌悬液，按3%接种量接种于pH值为3.5、3.0、2.5、2.0、1.5的YEPD 液体培养基中[16]。于28 ℃，150 r/min培养5 d，每12 h取1次样，将样品于10 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液，用无菌水重悬沉淀旋涡混匀后测定OD600，每个浓度重复3次。

1.3.5.3 数据分析

对于得到的OD600使用Microsoft Office Excel 2010处理，结果表示为Mean±SD形式。

2 结果与分析

2.1 分离纯化、形态及培养特征观察

从高糖、低 pH 的发酵液中，筛选具有典型酵母菌特征的菌落，通过形态学观察和显微镜检，从茶叶酵素中分离到2株菌Y1、Y2，从铁皮石斛花酵素中分离到1株菌Y3，从乌饭树叶中分离到2株菌Y4、Y5，从紫苏酵素中分离到1株菌Y6，从火龙果酵素中分离出1株菌Y7。7 株供试菌在固体、液体培养基上的菌落形态见表1，显微镜检图片如图1所示。初步表明该菌株符合酵母菌细胞形态特征。

表1 七株供试菌的菌落形态特征Table 1 Morphological characteristics of 7 yeast strains

图1 七株供试菌1 000倍显微镜检图Fig.1 Microscope photos of 7 tested strains(1 000×)

2.2 菌株鉴定结果

2.2.1 菌株的生理生化特征

7株菌的生理生化特征见表2。综合上述生理生化实验结果，根据《酵母菌的特征鉴定手册》和《真菌鉴定手册》，初步判断Y1、Y2、Y3、Y5属于接合酵母属，Y4、Y6属于酵母属，Y7属于毕赤酵母属。

表2 七株供试菌生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of 7 tested strains

2.2.2 分子生物学鉴定

利用NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3′)和NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)一对引物扩增7株供试菌26S rDNA近5′端的D1/D2 区域，得到约590～1 420 bp片段，供试菌的26S rDNA D1/D2区电泳结果见图2。

图2 七株供试菌的26S rDNA D1/D2区电泳结果Fig.2 Target gene electrophoresis of 7 tested strains

7株菌序列结果在GenBank数据库进行比对，结果显示Y1、Y2、Y3与鲁氏接合酵母的同源相似性均高于99%，Y4、Y6与酿酒酵母的同源相似性均高于99%，Y5与二孢接合酵母的同源相似性高于99%，Y7与异常威克汉姆酵母的同源相似性高于99%。同源菌株基因用MEGA7软件处理得到系统进化树，如图3所示。

图3 系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree

从图3可以看出，Y1、Y2和Y3与鲁氏接合酵母形成一个分支，验证可信度达到100%，Y4、Y6与酿酒酵母形成一个分支，验证可信度达100%，Y5与二孢接合酵母形成一个分支，验证可信度达100%，Y7与异常威克汉姆酵母形成一个分支，验证可信度达100%，初步确定Y1、Y2、Y3是鲁氏接合酵母，Y4、Y6是酿酒酵母，Y5是二孢接合酵母，Y7是异常威克汉姆酵母。

2.3 耐受性试验

2.3.1 高糖耐受性试验

Y1～Y7七株菌的高糖耐受性试验如表3所示，7株菌的生长趋势基本符合微生物的生长曲线，随着葡萄糖浓度的增大，7株菌的延滞期不断延长且7株菌均不能在900 g/L葡萄糖培养基中生长。Y1～Y7分别在经过了60、48、72、84、72、60 h的延滞期后，可在750 g/L葡萄糖培养基中生长。Y4仅能在经过了24 h的延滞期后，可在450 g/L葡萄糖培养基中生长。

表3 七株供试菌高质量浓度葡萄糖条件下光密度值变化Table 3 Changes in optical density of 7 tested strains under high concentration of glucose

WANG等[17]考察了高糖环境对鲁氏接合酵母生长的影响，发现随着糖含量的增加，鲁氏接合酵母的生长速率降低，培养基中菌体浓度也降低，表明菌种的生长受到抑制；YALÇIN等[18]研究表明，酿酒酵母可以在20～300 g/L高糖环境下生长，初始糖浓度越高，酿酒酵母的干重越低，表明菌种的生长受到抑制程度越高；李梦琦等[19]的研究表明400 g/L葡萄糖对鲁氏接合酵母的生长产生了一定的抑制作用。

2.3.2 低pH耐受性试验

Y1～Y7七株菌的低pH耐受性试验如表4所示，7株菌整体基本符合微生物的生长曲线，随着pH的降低，7株菌的延滞期不断延长，且仅Y6、Y7在经过了96、84 h的延滞期后能在pH 1.5的培养基中生长。Y1、Y2分别在经过了36、12 h的延滞期后，可在pH 2.5的培养基中生长。Y3、Y4、Y5仅能在经过12 h 的延滞期后，在pH 3.0的培养基中生长。

表4 七株供试菌低pH条件下光密度值变化Table 4 Changes in optical density of 7 tested strains under low pH

续表4

YAN等[20]发现随着培养基酸度的增加，酿酒酵母的生物量越低；AKINORI等[21]研究表明，培养基pH<2.5，pH越低酿酒酵母的生长受抑制程度越高，其延滞期越长；章之柱等[22]研究表明pH<3.5时，pH对菌株生长影响较大，与本研究结果基本一致。

3 结论

从茶叶酵素中筛选到2株菌Y1、Y2；从铁皮石斛花酵素中筛选到1株菌Y3；从乌饭树叶中筛选到2株菌Y4、Y5；从紫苏酵素中筛选到1株菌Y6；从火龙果酵素中筛选出1株菌Y7。Y1、Y2、Y3与鲁氏接合酵母的同源相似性均高于99%；Y4、Y6与酿酒酵母的同源相似性均高于99%；Y5与二孢接合酵母的同源相似性高于99%；Y7与异常威克汉姆酵母的同源相似性高于99%。Y1、Y2、Y3、Y5的最高耐受初始葡萄糖质量浓度为750 g/L，Y4最高耐受初始葡萄糖质量浓度为450 g/L，Y6、Y7的最高耐受初始葡萄糖质量浓度为600 g/L；初始葡萄糖含量越高，酵母菌的延滞期越长，酵母菌生长受到抑制程度越高，所有菌株均不能在初始葡萄糖质量浓度为900 g/L时生长。Y1、Y2的最低耐受初始pH值为2.5，Y3、Y4、Y5的最低耐受初始pH值为3.0、Y6、Y7的最低耐受初始pH值为1.5，培养基初始pH越低，酵母菌延滞期越长，酵母菌生长受到抑制程度越高。