刺梨汁中挥发性成分测定及其呈香贡献分析

李婷婷，黄名正，唐维媛,，李钦炀，娄康宁

1(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳，550025)2(贵州理工学院 食品与药品制造工程学院，贵州 贵阳，550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)，为蔷薇科多年生缫丝花的果实，其经济效益可观，且兼具对石漠化地区水土有保持作用，因而成为贵州省农村产业革命12特色产业之一，得到地方政府的极大支持，目前贵州省刺梨种植面积已达176万亩。刺梨富含VC、黄酮、植物多酚、多糖、多种必需氨基酸和超氧化物歧化酶等生理活性物质，具有免疫调节、抗癌和抗氧化损伤等生理医学功效[1-3]。

国内研究者在刺梨及其产品的挥发性成分等方面进行了一定的研究[3-9]，主要采用顶空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)技术提取挥发性成分。HS-SPME是将萃取纤维插入到溶液上部的空气中，进而吸附富集顶空部分的挥发性成分[10]，此方法操作简单、对易挥发成分的提取效率较好，但对沸点相对较高化合物的提取效率不佳[11]。溶剂辅助风味蒸发(solvent-assisted flavor evaporation，SAFE)技术是在高真空条件下，将液液萃取的液体中挥发性成分在低温下冷冻富集的一种香气提取方式，此方法既能避免产生氧化和水解产物，也能避免色素、油脂等成分进入到馏出液中干扰分析，得到的萃取物香气自然逼真[12]，故而适用于新鲜水果、蔬菜等的香气成分分析[13]。与HS-SPME相比，SAFE对易挥发性成分的提取效率较低，但对沸点相对较高的化合物具有良好的提取能力[11]。因此，将2种提取方法运用在刺梨及其产品中挥发性成分的检测，通过对比与互补，能够较全面地剖析刺梨及其产品中挥发性成分的组成[14]。

刺梨风味独特浓郁，香气是其鲜果及其产品的重要品质指标，利用现代风味分析方法揭示刺梨特征香气的化学成分，对解决刺梨种植和加工中存在的风味问题具有重要意义。目前采用SAFE法对刺梨汁中挥发性成分进行分析的工作少有文献报道。因此，本研究以刺梨汁为对象，采用HS-SPME和SAFE 2种提取方法，结合GC-MS对其挥发性成分进行分析比较，使用香气活度值(odor activity value，OAV)评估挥发性成分对刺梨汁香气的贡献，为刺梨贮藏和加工过程中的香气品质控制以及风味评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨(贵农5号品种)，贵州盘州市人工种植刺梨鲜果，已达到商业成熟度，新鲜无霉烂变质；环己酮(色谱纯)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；二氯甲烷(色谱纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；系列正构烷烃(C7-C30)(色谱纯)，Sigma-Aldrich公司；无水乙醇、二氯甲烷、无水硫酸钠、NaCl(分析纯)，成都金山化学试剂有限公司；高纯氦气、液氮，贵州国瑞气体技术有限公司。

1.2 仪器与设备

TQ8040 NX气相色谱质谱联用仪，日本Shimadzu公司；AOC-6000自动进样器、PAL自动固相微萃取装置、1 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维头，瑞士CTC公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；CS501超级恒温水浴，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；溶剂辅助风味蒸发装置(定制加工)，德国Glasbläserei Bahr公司；韦式蒸馏柱(定制加工)，江苏三爱思科学仪器有限公司；FF-100/110分子涡轮泵，北京中科科仪股份有限公司；HN200氮吹仪，济南海能仪器股份有限公司；DL-5M低速大容量冷冻离心机，湖南平凡科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨汁的制备

挑选新鲜成熟、无霉烂变质的刺梨鲜果，经去萼、去蒂、洗净、沥干、切分后榨汁，汁液在5 ℃环境下，以4 000 r/min离心5 min后取上清液，于-20 ℃下冻藏备用。

1.3.2 顶空固相微萃取

冻藏刺梨原汁在35 ℃水浴条件下进行解冻，称取1 g NaCl置于20 mL顶空瓶中，加入8 mL刺梨汁和50 μL环己酮(内标物)，用聚四氟乙烯隔垫密封。40 ℃下平衡15 min，保持40 ℃顶空萃取30 min后，插入GC进样口以不分流模式解吸附2 min。

1.3.3 溶剂辅助风味蒸发

冻藏刺梨原汁在35 ℃水浴条件下进行解冻，准确量取200 mL刺梨汁和10 μL环己酮于500 mL分液漏斗中，分别用50、40和30 mL的二氯甲烷依次萃取3次后合并萃取液，加入5 g无水硫酸钠至萃取液中除水后过滤。按图1安装SAFE装置[12]，将500 mL圆底烧瓶作为蒸馏瓶置于40 ℃恒温水浴锅中，将250 mL圆底烧瓶作为接收瓶置于液氮环境中，冷阱中也充满液氮。SAFE装置的蒸馏头夹层循环水浴温度为40 ℃，用分子泵使真空系统压力保持在1.0×10-4Pa，将120 mL刺梨汁的二氯甲烷萃取液由滴液漏斗缓慢、均匀地滴入蒸馏瓶中。待SAFE萃取液融化后再次加入5 g无水硫酸钠除水后过滤。将SAFE萃取液用韦式蒸馏柱浓缩至约2 mL，使用液氮吹至500 μL，-20 ℃密封保存，GC-MS待测。

1-滴液漏斗；2-蒸馏烧瓶；3-恒温水浴；4-蒸馏头；5-冷肼；6-接收瓶；7-保温瓶图1 SAFE装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the SAFE instrument

1.3.4 GC-MS分析条件

GC条件：色谱柱：InertCap Wax毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持3 min,以3 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；载气(He)流速1.88 mL/min；进样口温度240 ℃；进样量2 μL；分流比5∶1；溶剂延迟时间3.8 min。

MS条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质谱接口温度250 ℃；质量扫描范围(m/z)29～500。

1.3.5 化合物定性及定量

定性：挥发性成分经GC-MS分析后，通过美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)谱库检索选取相似度在80%以上的化合物进行初步定性，并采用线性保留指数 (linear retention index，LRI)进一步定性，结合相关文献资料，确定刺梨汁中的挥发性成分。LRI线性保留指数按公式(1)计算：

(1)

式中：n，正烷烃的碳数；ti，目标化合物的保留时间，min；tn，Cn的保留时间，min；tn+1，Cn+1的保留时间，min。

定量：挥发性成分的含量采用内标法进行定量，内标物为环己酮。即未知物的质量浓度可通过内标物的质量浓度和峰面积之间的关系，结合未知物的峰面积按公式(2)进行计算：

(2)

式中：As，内标物的峰面积；Ai，未知物的峰面积；ρs，内标物的质量浓度，μg/L；ρi，未知物的质量浓度，μg/L。

1.3.6 OAV计算

OAV是香气物质的浓度和该物质的阈值之比，用于评价各香气物质对样品香气的贡献度。通常认为 OAV≥1 的物质对样品风味有贡献[15]。按公式(3)计算OAV值：

(3)

式中：ρi，化合物的质量浓度，μg/L；OTi，该化合物在水中的阈值，μg/L。

1.3.7 数据处理与分析

所有试验均重复3次，结果采用平均值加减偏差的形式表示。通过Office 2007，Origin 8.0等软件进行处理、作图。

2 结果与分析

2.1 刺梨挥发性成分的GC-MS分析

采用HS-SPME和SAFE提取刺梨汁中挥发性成分，再经GC-MS联用仪检测出挥发性成分的总离子流图如图2所示。

a-HS-SPME;b-SAFE图2 HS-SPME和SAFE提取刺梨汁中挥发性成分的总离子流图Fig.2 Total ionic chromatogram of volatile components in Rosa roxburghii Tratt juice extracted by HS-SPME and SAFE

由图3和表1可知，HS-SPME提取检测到67种化合物，SAFE提取检测到86种化合物，共鉴定出119种化合物，包括酯类49种，醇类28种，酸类9种，醛酮类16种，萜烯类6种，芳香族9种，其他类2种。2种方法共同鉴定出的化合物有34种，酯类16种，醇类9种，酸类3种，醛酮类3种，芳香族3种。结合图2可知，2种提取方法对刺梨汁中挥发性物质的选择性存在差异，HS-SPME处理所得色谱峰主要集中在20～30 min，而SAFE处理所得色谱峰则集中在25～60 min。根据该色谱柱对挥发性成分的保留特性，极性较大的化合物通常出峰时间靠后，且往往沸点较高，较难挥发。进一步说明HS-SPME方法可有效吸附易挥发性物质，而SAFE则对较高沸点的化合物有良好的提取能力[11]。

图3 HS-SPME和SAFE提取刺梨汁中挥发性成分的数量及百分含量Fig.3 Quantity and percentage of volatile compounds in Rosa roxburghii Tratt juice extracted by HS-SPME and SAFE

2.1.1 酯类

水果中的酯类一般来源于脂肪酸和氨基酸途径衍生的直链或支链羧酸酯[14-15]。采用HS-SPME方法检测到33种酯类，SAFE方法检测到32种酯类，共同的酯类有16种，为刺梨带来浓郁的果香、花香和甜香。虽然2种方法在萃取物质的数量上没有太大差别，然而就具体种类而言，SAFE法分离到沸点高于100 ℃的酯类，进一步也说明SAFE法对较高沸点的化合物具有良好的提取能力。就酯类总含量而言，HS-SPME法检测到的酯类物质的总含量相比较SAFE法而言较高(表1)。HS-SPME中含量最高的酯类为(E)-3-乙酸己烯酯，占酯类总量的30%；SAFE中含量最高的酯类为2,3-丁二醇二乙酸酯，同样占酯类总量的30%。陈思奇等[5]报道了刺梨中含量最高的酯类物质为辛酸甲酯，本研究中通过HS-SPME方法检测到了大量的辛酸乙酯(10 075.58 μg/L)。采用SFAE方法首次在刺梨中检测到内酯类化合物，如γ-戊内酯、γ-丁内酯和γ-己内酯，一般具有椰子或桃香味特征[16]。

表1 刺梨汁中挥发性成分的定性定量结果Table 1 Qualitative and quantitative results of volatile compounds in Rosa roxburghii Tratt juice

续表1

续表1

2.1.2 醇类

植物中的挥发性醇类来自脂肪酸的氧化和氨基酸的降解[17]。HS-SPME和SAFE共检测到28种醇类，其中HS-SPME萃取出10种，SAFE法萃取出27种且总含量远高于前者，共有的醇类为9种，即1-戊烯-3醇、戊醇、(Z)-2-戊烯醇、己醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、(E)-2-己烯醇、辛醇和1,3-丁二醇。由此表明，SAFE法对刺梨汁中醇类化合物的萃取效果更优。由图3可知，醇类在刺梨汁所有挥发性成分中含量最高，HS-SPME中醇类百分含量为49.21%，SAFE中醇类百分含量为49.46%。陈思奇等[5]以龙里刺梨为研究对象，鉴定出刺梨中含量最高的化合物为酯类和烯烃类，导致该差异最可能的原因是刺梨的种植环境不同，在很大程度上会影响果实中挥发性物质的种类及含量。2种方法中含量最高的醇类均为(Z)-3-己烯醇，是由(Z)-3-己烯醛在乙醇脱氢酶的作用下代谢生成，具有新鲜的割青草和草药的良好风味[18]。HS-SPME中(Z)-3-己烯醇含量为25 448.56 μg/L，占醇类总含量的45%；SAFE中(Z)-3-己烯醇含量为226 007.46 μg/L，占醇类总含量的57%。相比于文献已报道的刺梨挥发性成分中的醇类物质[4-6, 9]，本研究采用2种提取方法可检测到更多种类的烯醇类物质，分别是(E)-2-戊烯醇、(Z)-2-戊烯醇、2,6-二甲基-3,5-庚二烯-2-醇、(E)-3-己烯醇、(E)-2-己烯醇、(Z)-2-己烯醇、3-己烯-2,5-二醇。这可能与SAFE法对沸点较高的烯醇类提取的高效率和HS-SPME法相对有限的吸附能力有关。

2.1.3 酸类

水果中挥发性酸类主要来源于脂肪酸的氧化[19]，在脂肪酸生物合成期间，也可以通过酸部分和酰基载体蛋白间的缀合物合成和水解来产生挥发性酸[18]。由表1可知，刺梨中酸类含量最高的均为辛酸，其具有奶酪、脂肪和酸臭气味，HS-SPME法中辛酸含量为11 324.09 μg/L，占酸类总含量的89%，SAFE法中辛酸含量为184 398.75 μg/L，占酸类总含量的88%，与文献报道相一致[4, 6, 9]。2种提取方法共检测到9种酸类，共有的酸类为3种，即乙酸、己酸和辛酸，其他6种酸类仅在SAFE中检测到，也是首次在刺梨中分析检测到此类酸类化合物，分别是异丁酸、丁酸、(E)-3-己烯酸、(E)-2-己烯酸、(E)-3-辛烯酸和癸酸。SAFE法检测得到的9种酸类物质相对百分含量达到26.29%，表明SAFE法对于脂肪酸类物质萃取效果更好。2种提取方法所提取到的酸类物质种类及含量的差异较大，原因是酸的沸点一般较高，挥发性相对较弱，固相微萃取纤维头不易吸附到酸类物质，SAFE法更有利于酸类物质的提取。

2.1.4 醛酮类

果实中的直链醛、酮多数是由脂肪酸氧化和氨基酸代谢而来。C18-不饱和脂肪酸如亚油酸和亚麻酸，均是挥发性直链醇、醛、酮、酸、酯和内酯的生源前体，主要由3个代谢过程生成香气物质：α-氧化、β-氧化、脂氧合酶途径[18]。2种方法共检测到刺梨汁挥发性成分中有16种醛酮类，包括5种醛类和11种酮类，且提取的醛酮种类和含量有较大差异，HS-SPME法萃取到4种醛类和4种酮类物质，SAFE法萃取到2种醛类9种酮类，共有的醛类仅1种，共有的酮类仅2种。呋喃酮类化合物主要来源于碳水化合物，在刺梨汁中使用SAFE法检测到了大量的4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮，该化合物具有愉悦的焦糖、可可和咖啡等气味，研究报道D-果糖-1,6-二磷酸是其生源前体[20]，二磷酸己糖生成中间体4-羟基-5-甲基-2-亚甲基-3(2H)-呋喃酮后，草莓烯酮氧化还原酶催化底物生成呋喃酮[21-22]，O-甲基转移酶再将呋喃酮转化为甲氧基呋喃酮[23]。SAFE法萃取到更多的酮类是因其沸点相对较高，挥发性较弱，SPME法对其萃取效率较低。综合来看，若要对刺梨汁中醛酮类挥发性成分有较全面的分析，应采用2种提取方法结合分析。

2.1.5 萜烯类

萜类的生源前体是活性异戊二烯C5单元二甲基烯丙基二磷酸和异戊烯基二磷酸，由碳水化合物提供的乙酰辅酶A和丙酮酸通过质体和细胞质中的独立途径从头合成[17, 24]，主要以非挥发性糖苷的形式存在，但也以游离的挥发性形式存在。HS-SPME法检测到的是(Z)-β-罗勒烯、α-沉香呋喃和4-萜烯醇，前2种萜类在先前对刺梨的研究中均有报道[4-5]；SAFE法检测到的是异香叶醇、环萜烯醇和3-氧代紫罗兰醇。2种方法共检测到6种萜类，其含量均较低。与文献报道相比[5-6, 9]，本研究中检测到的萜烯类化合物的种类较少，可能与果实采后贮藏、果汁制备、提取及检测系统的差异有关。

2.1.6 芳香族

苯丙烷类和苯类物质来源于芳香族的苯丙氨酸，苯丙氨酸是由莽草酸/芳族酸途径生成的[25]。2种方法共检测到9种芳香族物质，其中HS-SPME法检测到8种，SAFE检测到4种，共同检测到的芳香族物质有3种。就化合物种类而言，相较于SAFE法，HS-SPME法可萃取到更多种类的芳香族化合物。2种方法中含量最高的芳香族均为榄香素，HS-SPME和SAFE法中榄香素的含量分别为333.16 和5 806.91 μg/L，该化合物在先前对刺梨汁挥发性成分的研究中也有报道[7]。榄香素具有花香味，是烘焙食品、肉类、非酒精饮料或冰激凌中添加的芳香食品的主要成分之一[26]。

2.2 刺梨汁中挥发性成分的OAV分析

使用HS-SPME和SAFE法在刺梨果汁中共分离检测到119种挥发性化合物，但不是所有的挥发性物质都对香气具有贡献，贡献的显著性取决于果汁中化合物的浓度及其气味阈值。OAV是常用的评估挥发性成分呈香贡献的一种方法，当挥发性物质的OAV ≥1时，该物质才能被人体感知，并对样品的香气具有贡献[27]。

如表2所示，对76种化合物的OAV进行分析，HS-SPME法和SAFE法中OAV≥1的化合物分别有39种和38种，共同的化合物有21种。其中，2-甲基丁酸乙酯在2种方法中OAV均为最大，在HS-SPME中的OAV是135 907， SAFE中的OAV是105 327，说明2-甲基丁酸乙酯对刺梨汁的香气贡献度最大。2种方法所得的OAV较大的酯类几乎相同，其酯类的阈值较低，OAV较大，对刺梨汁的特征气味贡献较大，通常带有浓郁的成熟水果的香气、花香和甜香等气味。刺梨的果香、甜香和花香气味突出与周志等[4]采用气相色谱-闻香法对野生刺梨汁的香气轮廓进行评价的结果较为一致。

表2 OAV确定刺梨汁中具有香气贡献的化合物Table 2 Aroma-contributing compounds in Rosa roxburghii Tratt juice identified by OAV

续表2

2种方法所得醇类中OAV最大的均为(Z)-3-己烯醇，其在HS-SPME中的OAV为364，SAFE中的OAV为3 229，醇类对刺梨汁中生青味、草药和脂肪等气味具有较大贡献。酸类阈值较高，所以其OAV较小，对刺梨汁的特征气味贡献不大，如HS-SPME中仅有辛酸OAV>1，SAFE中辛酸和异丁酸的OAV分别为61和6。醛类化合物中，OAV≥1的共有4种，HS-SPME中OAV最大的为壬醛，为72，SAFE中除苯甲醛的OAV为1外，其余均没有呈香贡献。酮类化合物中OAV≥1的共有5种化合物，2种方法中OAV最大的均为2-庚酮，其具有奶酪和肉桂气味，4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮阈值虽然很高，但因含量很高也具有明显的香气贡献(OAV=110)。芳香族的阈值较低，但2种方法检测到的芳香族的含量也较低，故OAV较小，对刺梨汁的特征气味贡献度相对较小。

综上分析，刺梨汁的特征气味主要由酯类、醇类和醛酮类等物质构成。周志等[4]利用气相色谱-闻香法鉴定出野生刺梨汁中游离态的香气活性物质有21种，包括酯类6种、醇类4种、萜烯类5种、醛类1种、芳香族2种、酸类1种和吡喃类1种。陈思奇等[5]通过计算相对气味活度值(relative odor activity value, ROAV)得出刺梨汁中ROAV≥1的挥发性成分有12种，分别是辛醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、异草香醇、α-柠檬烯、α-蒎烯、壬醛、辛酸甲酯和反式-石竹烯。与文献报道相比，本研究采用2种提取方法能富集更多刺梨汁中挥发性成分的种类，并结合OAV分析可知，有16种挥发性成分首次被鉴定为对刺梨整体香气具有较大贡献的化合物，分别是2-甲基丁酸乙酯、异丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、2-乙酸戊酯、3-乙酸戊酯、(E)-3-乙酸己烯酯、乙酸己酯、乙酸异丁酯、(E)-2-己烯醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、2,3-丁二醇、(E)-2-戊烯醇、2-庚酮、4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和2-甲基萘。

3 结论

本研究首次采用HS-SPME和SAFE结合的方法提取刺梨汁中挥发性成分，经GC-MS分析分别检测到67种和86种化合物，合计共鉴定出119种挥发性成分，包括49种酯类，28种醇类，9种酸类，16种醛酮类，6种萜烯类，9种芳香族和其他类2种，2种方法共同检测的到相同的化合物有34种。由于不同挥发性成分的沸点不同，2种提取方法所得刺梨汁挥发性成分的种类及含量存在差异，HS-SPME能有效提取沸点较低、挥发性较强的化合物，SAFE有利于提取沸点较高、挥发性较弱的成分，将2种提取方法结合起来，能够对刺梨汁挥发性成分进行较全面的分析。通过OAV分析，共计有38种化合物对刺梨的香气有主要贡献作用，主要为酯类、醇类和醛酮类。本研究丰富了刺梨挥发性成分的种类，并评估了挥发性成分对刺梨香气的贡献，其中有16种挥发性成分首次被鉴定为刺梨汁中的香气活性成分，分别是2-甲基丁酸乙酯、异丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、2-乙酸戊酯、3-乙酸戊酯、(E)-3-乙酸己烯酯、乙酸己酯、乙酸异丁酯、(E)-2-己烯醇、(E)-3-己烯醇、(Z)-3-己烯醇、2,3-丁二醇、(E)-2-戊烯醇、2-庚酮、4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和2-甲基萘。