绵羊BTG2 基因CDs 区克隆、生物信息学分析及组织mRNA 表达研究

高 一 ，刘理想,2，肖 成，金海国，马惠海，薛佳佳,2，魏 天，曹 阳*

（1.吉林省农业科学院动物生物技术研究所，吉林公主岭 136100；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118）

小尾寒羊B 细胞易位基因2（B-cell TranslocationGene 2，BTG2）是首个被鉴定的新型抗增殖因子BTG/TOB 基因家族成员[1]，位于染色体的1q32 位点，编码150 个氨基酸，BGT2也被命名为TIS21、PC3，是分别表达于人类、小鼠、大鼠的同源基因[2-3]。BTG/TOB家族包括Pc3/Tis21/BTG2、Btg1、Tob、Tob2、Ana/Btg3、P c3k等，成员众多且来自不同物种，有些命名与最初概念有一点不同，为便于记忆和理解，根据该家族抗增殖功能统一命名为APRO（Anti-Proliferative），因此BGT2又名为APRO1[4]。BTG/TOB 家族成员结构的共同特征是蛋白分子的N-末端存在2 个约110 个高度保守氨基酸组成的同源区A box 和B box，其中A box具有抗增殖的作用，而B box 与许多靶分子结合起作用，A box 和B box 被一段非保守的氨基酸序列隔开，2 个保守区与调节细胞周期的CCR4 相关因子1（Caf1）有关[5]。且BTG/TOB 基因家族存在一些影响哺乳动物细胞RNA 稳定性的ATTTA 基序[4,6]，与其他家庭成员相比，BTG1和BTG2还具有C Box[7]。BTG2在各种器官和组织中表达，如脾脏、胸腺、肺、胃和大肠，在肺、肠、胰腺和前列腺[8]，能够阻滞细胞在G1/S 和G2/M 的过渡、增加凋亡[9]，促进维甲酸诱导的细胞分化造血细胞[10]和抑制胸腺细胞的扩张[11]。此外，该基因具有促进神经元分化发育，抑制细胞增殖[9,12]，依赖p53 机制调控DNA 损伤修复[13]等生物学功能。

随着研究深入挖掘，BTG2基因逐步成为畜牧业领域中研究热点，并在羊中的功能研究取得一定成果。在滩羊尾部脂肪沉积的研究中发现，BTG2表达量与尾部脂肪沉积指标呈正相关，能促进脂肪沉积[14]。另有报道表明BTG2基因可以作为多脊椎小尾寒羊的候选的分子标记或位点[15]。在特克赛尔（Texel）和乌珠穆沁试验发现，BTG2对绵羊胎儿中后期骨骼肌发育有重要作用，且可能参与myostatin 调节通路[16]。本实验拟克隆小尾寒羊BTG2基因CDs 区，并对其进行生物信息学分析，同时检测该基因在羔羊期不同组织中的mRNA表达情况，旨在为进一步探索BTG2基因在羔羊期的生理学作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料采集 3 日龄和40 日龄的小尾寒羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、背最长肌组织，存于冻存管中，液氮保存。

1.2 主要试剂 Trizol 购自Invitrogen 公司；2xEs Taq Master Mix（dye）购自康为世纪；DNA Marker2000bp、PrimeScriptRTTMreagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex taqTM、pMD18-T 载体购自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 购自OMEGA 公司。引物、测序均由金唯智生物技术有限公司完成。

1.3 引物设计与合成 根据NCBI 数据库中绵羊BTG2基因CDs 序列，使用Primer Premier5.0 软件设计特异性引物及定量引物（表1），选取β-actin为内参基因。

1.4BTG2基因CDs 区克隆 提取绵羊肌肉组织RNA，反转录获得cDNA。PCR 扩增体系：2×Master Mix 10 μL，1 μmol/L F-primer 0.4 μL，1 μmol/L R-primer 0.4 μL，50 ng/μL cDNA 1.2 μL，补充ddH2O 至20 μL。扩增程序：98℃ 5min；98℃ 10 s；61℃ 30 s；72℃30s，30 个循环；72℃ 7 min。

PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测并进行胶回收。采用TA 克隆的方法，将回收产物与pMD18-T载体16℃孵育30min 进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，随后涂布在氨苄青霉素平板上，于37℃培养箱中倒置过夜，挑取单克隆菌落于含有氨苄的液体培养基中，37℃、200 r/min 摇床震荡过夜。最后进行菌液PCR 鉴定，并送往苏州金唯智生物公司测序。

1.5 生物信息学分析 将绵羊BTG2基因序列在NCBI中BLAST 比对同源性，利用MEGA-X 软件构建绵羊、牛、猪、人、大鼠、小鼠、虎鲸系统进化树；根据在线软件http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html 分析蛋白分子量；https://web.expasy.org/protparam/ 分析蛋白的基本理化性质；https://web.expasy.org/protscale/ 分析蛋白氨基酸序列的亲疏水性；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/预测氨基酸序列信号肽；TMHMM-2.0分析蛋白的跨膜区结构；http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ 和https://psort.hgc.jp/form2.html 预测蛋白的亚细胞定位；https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.p 和http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/分析蛋白的二级结构；http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/分析蛋白三级结构。

1.6BTG2基因在绵羊各组织中的表达分析 提取3 日龄和40 日龄绵羊各组织RNA，进行反转录，qPCR 检测BTG2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠、肌肉中的mRNA 表达量。PCR 扩增体系：SYBR®Premix Ex taqTM10 μL，cDNA 1.5 μL，F-primer 0.4 μL，R-primer 0.4 μL，补充ddH2O 至 20 μL。反应程序：95℃5 min；95℃ 10 s；60℃15 s，72℃ 20 s，共40 个循环；72℃ 7 min。熔解曲线分析：95℃ 5 s；65℃ 1 min，每个待测样品设置3 个重复，采用2-ΔΔct方法分析相对表达水平。

表1 引物序列信息

1.7 统计分析 采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 6 软件对数据进行单因素方差分析，数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1BTG2基因CDs 区序列克隆 以肌肉组织cDNA为模板，PCR 扩增得到一条453 bp 的特异性片段（图1），与预期长度相符。同时用TA 克隆的方法，测序比对序列正确，表明本实验成功克隆出绵羊BTG2基因 CDs 区。

2.2BTG2基因序列的生物信息学分析。

图1 BTG2 琼脂糖凝胶电泳图

2.2.1 同源性比对及系统进化树构建 通过NCBI 中BLAST 对绵羊BTG2基因CDs（NM_001246210.1）核苷酸序列与牛（XM_002693879.5）、猪（XM_018059998.1）、人（NM_006763.3）、大鼠（NM_017259.1）、小鼠（NM_007570.2）、虎鲸（XM_004282488.2）进行同源性比对，比对结果显示绵羊与牛、猪、虎鲸、人、大鼠、小鼠同源性分别为98.9%、90.29%、94.04%、88.52%和85.65%、86.98%，说明该基因在生物进化过程中比较保守。利用MEGA-X 软件邻近法（Neighbor-Joining Method，NJ）构建核苷酸系统进化树模型，发现物种进化过程中绵羊与牛的亲缘关系最近，与小鼠的亲缘关系最远（图2）。

图2 BTG2 基因系统进化树

2.2.2 绵羊BTG2 蛋白理化性质 利用在线ProtParam软件分析BTG2 蛋白的理化性质，结果显示BTG2基因编码150 个氨基酸，根据氨基酸残基组成表（表2）可知含量最高的是亮氨酸（11.3%），不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸。蛋白的分子式C748H1190N208O213S8，分子质量为17 ku，理论等电点（pI）为9.14，肽链N 端为蛋氨酸（Met），半衰期为30 h。其水溶液在280 nm 处的消光系数为21680，不稳定系数为48.51，属于不稳定蛋白，脂肪系数为94.27，亲水性总平均值为-0.123。根据ProtScale 在线软件对蛋白做进一步的疏水性分析（图3），其中纵坐标0 值以上为疏水区，分值越高疏水性越强，0 值以下为亲水区，分值越低亲水性越强。由图3 可知，多肽链的第9 位氨基酸分值最高为2.167，第47 位氨基酸分值最低为-2.111。该氨基酸序列亲水性残基多于疏水性残基，因此整体表现为亲水性，与ProtParam 软件预测蛋白亲水性结果相同。

表2 BTG2 蛋白氨基酸组成

图3 BTG2 蛋白亲疏水性分析

2.2.3 绵羊BTG2 蛋白跨膜区预测及信号肽分析 TMHMM在线软件对BTG2 蛋白的跨膜结构进行预测，结果显示1～150 的氨基酸都位于膜外，不存在跨膜结构。在线软件SignalP 对BTG2 蛋白信号肽进行预测，结果表明该蛋白不存在信号肽序列，也就说明该蛋白不是分泌型蛋白。

2.2.4 绵羊BTG2 蛋白亚细胞定位 使用TargetP、PSORT II 分别预测蛋白质的亚细胞定位（表3），分析显示BTG2 存在于分泌信号通路位点（mTP）、线粒体作用位点（SP），所占比例均很小。蛋白主要分布于细胞核，线粒体上、细胞质、细胞壁、分泌系统的囊泡、细胞支架中也有分布。

表3 绵羊BTG2 蛋白亚细胞定位

2.2.5 BTG2 蛋白高级结构预测 运用SOPM 软件预测BTG2 蛋白二级结构，结果显示α-螺旋、β折叠股（β股）、β-转角和无规则卷曲分别占36%、20%、4.67%和39.33%。利用psipred 软件再次预测二级结构（图4），结果与SOPM 预测相一致，显示蛋白结构主要由α-螺旋（Helix）、无规则卷曲（Coil）)和β股（Strand）构成，为混合型蛋白。Phyre2 在线软件对BTG2 的三级结构预测（图5），其主要构成仍为α-螺旋、无规则卷曲和β股，与二级结构预测基本一致。并用JSmol 软件进行查看，其结果与模板序列可信度（confidence）100%，模型精度（identify）92%。

图4 BTG2 蛋白二级结构预测

图5 BTG2 蛋白三级结构预测

图6 BTG2 基因在绵羊不同组织中的表达

2.3BTG2基因在不同日龄不同组织间的表达分析qPCR 方法检测结果如图6 所示，以BTG2 在3 日龄的心脏表达量作参照组，BTG2基因在各组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠和肌肉）中均有表达，且无论在3 日龄还是40 日龄阶段都以肝脏中表达量最高（P＜0.001）；经数据分析，在心、肝、脾、肺组织中，40 日龄BTG2 表达量极显著高于3 日龄，而在肾脏、肠和肌肉中，40 日龄极显著低于3 日龄。也就是说在3日龄至40 日龄阶段，随着日龄增长，BTG2基因在心、肝、脾、肺组织中表达量增加，在肾脏、肠和肌肉中表达趋势降低。

3 讨 论

本实验对绵羊BTG2基因核苷酸序列与其他几个物种进行同源性比对，比对结果与系统进化树结果保持一致，显示绵羊与牛的亲缘关系最近，与小鼠的亲缘关系最远，证实了BTG2序列在物种间具有高度保守性，符合生物进化的特征，且具有广泛的同源性。蛋白质结构的特征是疏水/亲水间的平衡，其结构的稳定在很大程度上有赖于分子内的疏水作用，软件分析该氨基酸序列亲水性残基多于疏水性残基，表现为亲水性，也进一步说明BTG2属于不稳定蛋白。BTG2 蛋白跨膜结构的预测结果显示不存在跨膜结构，且1～150 的氨基酸都位于膜外，与蛋白的亲水性区域分析结果基本一致。对其进行信号肽预测，发现BTG2 蛋白氨基酸序列不存在信号肽，意味着不能够将新合成的蛋白质引导向分泌通路，不属于分泌蛋白。亚细胞定位预测显示，该蛋白主要分布于细胞核和线粒体上，鉴于2 个细胞器在细胞内发挥的重要功能，提示BTG2 蛋白可能通过接受外来信号参与细胞的遗传代谢、细胞周期、凋亡和分化等过程。根据目前已有的BTG2研究来看，可以肯定的是BTG2确实参与细胞周期负调控、抑制细胞增殖、DNA 损伤修复及肿瘤抑制等过程。该基因蛋白二级、三级结构预测结果相一致，显示以α-螺旋、无规则卷曲为主。

BTG2基因在不同日龄羔羊组织中qPCR 检测结果表明，该基因在各组织中广泛分布。存在于心脏、肺脏、肾脏中，说明其参与呼吸和泌尿的可能性；表达在肝脏和肌肉中，提示其可能参与脂类代谢、糖代谢等调控过程；在肠中表达，说明其可能在机体消化、促生长方面具有重要作用；在脾脏中表达，推测其与免疫功能有关。数据进一步分析发现，BTG2在各组织中表达存在差异，但以在肝脏中表达量最高，表示BTG2可能与脂代谢、糖代谢等过程密切相关。关于BTG2的研究中，有研究人员发现包括BTG2在内的6 个基因（BTG2、PDHB、SORBS1、TRDN、TTN和MGP）在肌间脂肪含量不同的日本和牛中存在差异表达[17]。此外，有研究表明BTG2能够通过Stat3 信号通路的来抑制前脂肪生成活性，在前脂肪细胞分化过程中，呈现波动表达趋势[18]。在滩羊尾部脂肪沉积的探索试验结果表明，BTG2表达量则对尾部脂肪沉积指标呈正相关，能促进脂肪沉积[14]。并有报道证明，经cAMP 信号通路，BTG2与肝糖生成相关基因协同上调，可致肝糖含量增加[6]。这些研究结果提示BTG2基因与脂代谢、脂肪沉积乃至碳水化合物的积累存在紧密关联。对数据深入分析发现，在3～40 日龄阶段，随着日龄增长，BTG2基因在心、肝、脾、肺组织中表达量增加，但在肾脏、肠和肌肉中表达量降低。本研究推测BTG2于不同时间段在各组织中发挥的作用不同，所以表达趋势有所变化，但具体功能作用和机制仍不清楚，有待后续进一步的细化研究。

4 结 论

本实验成功克隆BTG2基因蛋白编码区，并对其进行生物信息学分析，结果显示小尾寒羊BTG2基因CDs区长度453 bp，分子质量为17ku 的亲水性的不稳定蛋白，不存在跨膜结构和信号肽，蛋白主要分布于细胞核，存在于分泌信号通路位点，高级结构由α-螺旋、无规则卷曲和β股构成，并在在生物进化过程具有保守性。通过对该基因的3 日龄和40 日龄的羔羊期组织表达图谱分析，BTG2在在各组织中的广泛分布且表达趋势不同，以肝脏中表达量最高，且随着日龄增长，该基因在心、肝、脾、肺组织中表达量增加，在肾脏、肠和肌肉中表达量降低。本实验结果支持BTG2与脂代谢相关这一观点，但还需更多的实验数据来提供支持和验证。