月桂酸单甘油酯对花鲈脂质代谢的影响

2021-02-28孙彩云董宏标王文豪古群红段亚飞张家松许晓东

南方水产科学 2021年1期

孙彩云，董宏标, ，王文豪，李勇，古群红，段亚飞,，张家松,，许晓东

（1.水产科学国家级实验教学示范中心 (上海海洋大学)，上海 201306；2.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室/广东省渔业生态环境重点实验室，广东广州 510300；3.中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，广东深圳 518121；4.珠海市现代农业发展中心，广东珠海 519070；5.珠海德洋水产养殖有限公司，广东珠海 519000）

花鲈 (Lateolabrax maculatus) 又称海鲈、七星鲈等，广泛分布于中国沿海地区。因其生长快、营养价值高、肉质鲜美，兼具广盐、广温性，深受养殖户喜爱，是中国海水鱼养殖的主要种类之一[1-3]。随着养殖规模的持续扩大，生产上愈发追求低成本高产出，而高密度、投饵过度、饲料能量过高或变质等会造成鱼类脂质代谢障碍，机体抗氧化能力和免疫力下降，脂肪肝诱发几率大大增加，影响生产性能和水产品品质，制约花鲈养殖业的健康可持续发展[4-5]。

月桂酸单甘油酯 (Glycerol monolaurate,GML)又称十二酸单甘油酯，属于中链脂肪酸 (Mediumchainfatty acids,MCFAs)，天然存在于母乳、椰子油和美洲蒲葵中，也可通过直接酯化来源于天然油脂的月桂酸和甘油得到，具有乳化和防腐双重功能，还具有抗菌、抗病毒等多种生物学特性，是美国食品与药物管理局 (FDA) 和中国均已批准使用的食品和饲料添加剂[6]。GML 用作食品添加剂主要起到防腐保鲜的作用；用作畜禽饲料添加剂，可起到加快生长速度、提高抗病性以及促进动物肝脏脂肪酸氧化、脂质代谢和改善肌肉品质等作用[7-10]。

目前，GML 虽然在畜禽养殖中已经得到广泛应用，但在养殖鱼类中研究较少，而在花鲈养殖中应用的研究尚未见报道。本文以花鲈为研究对象，通过拌喂不同剂量的GML，探讨其对花鲈脏器系数、肝脏组织形态、血清生化指标、抗氧化能力以及脂质代谢的影响，以期为GML 作为绿色添加剂在花鲈饲料中的应用提供实验依据，亦可为鱼类脂肪肝改善提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 饲料制备

实验所用GML 购自广东省脂类科学与应用工程技术研究中心。将GML 用无水乙醇溶解后，分别以0、1 000、2 000 和4 000 mg·kg−1的添加量与基础饲料均匀混合，自然风干后备用。

1.2 实验设计与饲养管理

本实验所用花鲈购自珠海市当地某养殖场，养殖实验于珠海德洋水产养殖有限公司的室外水泥养殖池内的围隔网箱 (1.5 m×1.2 m×1.0 m) 中进行。实验开始前将花鲈置于室内方形水泥池 (4 m×2.5 m×1 m) 中暂养14 d，暂养期间每天08:00 和18:00 饱食投喂2 次鲈鱼配合饲料 (珠海海龙生物饲料有限公司)。暂养结束后，随机选取体表无损伤、规格相近、平均体质量为 (230±20) g 的花鲈共320 尾，分为4 组，每组4 个重复，每个重复为一个网箱，每个网箱放养20 尾。各实验组按对应饲料投喂，养殖8 周，每天08:00 和18:00 饱食投喂2 次，实验期间水温 (28±2) ℃，pH 7.6～8.2，溶解氧质量浓度大于6.0 mg·L−1，自然光周期。

1.3 样品采集

养殖实验期间，分别在第0、第2、第4、第8 周取样。每个取样时间点，实验鱼饥饿24 h，每个重复组随机捞取1 尾实验鱼，合计每个实验组共4 尾。实验鱼在200 mg·L−1的MS-222 中迅速麻醉后，测量体质量、体长，1.5 mL 无菌注射器尾静脉取血，取全血样品在4 ℃下静置1 h，待血液分层后，以3 000 r·min−1离心10 min，最后收集血清于1.5 mL 离心管，−80 ℃保存备用。采血后，置于冰盘上解剖，分别称量内脏团、肝脏和腹脂质量，取肝脏于2 mL 离心管中，−80 ℃保存备用。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 脏器系数计算根据以下公式计算腹脂率(Intraperitoneal fat ratio,IPF)、肝体比 (Hepatosomatic index,HSI)、肥满度 (Condition factor,CF) 和脏体比 (Viscerosomatic index,VSI)。

式中W为鱼体质量 (g)；Wi为腹脂质量 (g)；Wh为肝脏质量 (g)；Wv为鱼内脏团质量 (g)；L为体长 (cm)。

1.4.2 肝脏组织切片制备及观察肝脏组织切片的制作与观察参照区又君等[11]的方法进行，主要步骤为：将麻醉后的实验鱼解剖，取出肝脏后用0.86% 的生理盐水冲洗干净，取肝脏一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 以上。制作切片前取出，经过流水冲洗、70%～100%的乙醇脱水和二甲苯透明，经石蜡包埋处理后，连续切片，切片厚度为5～6 μm，进行HE 染色和中性树脂封片，室温风干，于显微镜下观察并拍照。

1.4.3 血清生化指标测定采用全自动生化分析仪 (BS200) 测定血清中总胆固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶 (AST)，均用商业试剂盒 (深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司) 检测。

1.4.4 肝脏抗氧化指标和脂质代谢相关指标测定肝脏中超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、脂肪酸合成酶 (FAS)、乙酰辅酶A 羧化酶 (ACC)、脂蛋白脂酶 (LPL)、还原型谷胱甘肽(GSH) 和丙二醛 (MDA) 等的测定均采用商业试剂盒 (南京建成生物工程研究所，中国)，测定方法依照说明书。

1.5 数据统计与分析

2 结果

2.1 饲料中添加GML 对花鲈脏器系数的影响

与对照组相比，各处理组肝体比在第4 周均显著降低，低剂量组显著低于其他组 (P<0.05)；处理组的腹脂率均显著低于对照组，其中，中剂量组降低最明显 (P<0.05，图1)；饲料中添加GML 的水平对花鲈肥满度和脏体比的影响不显著 (P<0.05)。

2.2 饲料中添加GML 对花鲈肝脏组织形态的影响

观察图2 (第4 周) 和图3 (第8 周) 肝脏组织学切片发现，各组肝细胞内均有大小不一的脂肪滴，对照组由于肝细胞被脂肪滴充斥，细胞呈透明空泡化，且细胞核被挤压到一侧，发生核偏移；各GML 添加组花鲈肝脏细胞中脂滴减少，脂肪空泡化明显减轻，脂质沉积现象有所缓解，且以中剂量组效果最明显。

2.3 饲料中添加GML 对花鲈血清学指标的影响

与对照组相比，第4 和第8 周各处理组TG 的浓度显著降低 (P<0.05，图4)；第4 周各处理组TC 浓度显著低于对照组 (P<0.05)；低剂量组和中剂量组LDL-C 和ALT 均有明显降低 (P<0.05)；而HDL-C 浓度在第4 周出现显著性升高，且中剂量组要显著高于其他组 (P<0.05)；中剂量组第8 周AST 活性降低最明显 (P<0.05)。

2.4 饲料中添加GML 对花鲈抗氧化相关指标的影响

拌喂GML 后，各GML 添加组花鲈肝脏中GSH-Px 活性在第2 和第4 周均有明显升高 (P<0.05，图5)；SOD 活性和GSH 浓度在第4 和第8 周较对照组均有显著上升 (P<0.05)；而MDA 浓度较对照组均显著降低，且在第4 周中剂量组显著低于其他组 (P<0.05)。

2.5 饲料中添加GML 对花鲈脂质代谢的影响

与对照组相比，拌喂GML组花鲈FAS 和ACC活性均有降低，且各GML添加组间无明显差异(P<0.05，图6)；而各处理组LPL 活性均显著升高，且中剂量组显著高于其他组 (P<0.05)。

3 讨论

3.1 GML 对花鲈脏器系数的影响

图1 饲料中添加月桂酸单甘油酯对花鲈脏器系数的影响相同采样点上标字母不同表示差异显著 (P<0.05)；图4、图5、图6 同此Figure 1 Effects of dietary GML level on organ coefficients of L.maculatusValues with different superscript letters for the same time are significantly different (P<0.05).The same case in Figure 4,Figure 5 and Figure 6 .

图2 第4周饲料中添加月桂酸单甘油酯对花鲈肝脏组织形态的影响 (10×40 倍)a.对照组；b.低剂量组；c.中剂量组；d.高剂量组；FD.脂肪滴；N.细胞核；图3 同此Figure 2 Effects of dietary GML level on liver histological structure of L.maculatus in 4th week (10×40 times)a.Control group;b.Low-dose group;c.Medium-dose group;d.High-dose group;FD.Fat dripping;N.Nucleus.The same case in Figure 3.

图3 第8周饲料中添加月桂酸单甘油酯对花鲈肝脏组织形态的影响 (10×40 倍)Figure 3 Effects of dietary GML level on liver histological structure of L.maculatus in 8th week (10×40 times)

在高密度集约化养殖条件下，低蛋白和高脂肪水平配合饲料的大量使用，导致鱼体脂肪极易蓄积[12]。鱼类体脂沉积主要集中于肝脏、腹腔和肌肉等部位，而腹腔脂肪大量蓄积会影响鱼类营养代谢、降低生产性能和免疫力，导致疾病爆发，乃至引发鱼体大量死亡[13]。本研究拌喂GML 后，花鲈腹脂率均显著降低，肝体比第4 周降低明显，表明适量拌喂GML 可有效减少花鲈肝脏和腹腔脂肪的蓄积。这与刘梦芸等[14]和Belghit 等[15]的研究结果类似，他们发现饲料中添加GML 可降低蛋鸡腹脂率和大西洋鲑 (Salmo salar) 的肝脏脂肪含量。此外，有研究发现在公牛饲粮中加入椰子油 (椰子油是最重要的月桂酸类油脂，在机体消化吸收过程中可形成GML)，也类似的显著降低了胴体质量和体脂含量[16-17]。本研究结果与之相似，饲料中添加GML 可促进花鲈脂质的快速氧化，减少脂肪蓄积，改善鱼体品质。

3.2 GML 对花鲈血清学指标的影响

鱼类血清生化指标与机体代谢、营养水平及疾病联系密切，可以较好地反映鱼体的生理代谢情况，也是衡量其健康水平的重要检测指标[18]。由于脂质在体内的运输主要借助于血液，所以血清中TC 和TG 的浓度可在一定程度上反映机体脂质代谢程度[19-20]。脂质在运输时，需要以脂蛋白为载体，通过HDL-C 和LDL-C 等形式在肝脏和血液之间转运[21]。血清中HDL-C 的降低或者LDL-C 的升高，都将影响肝脏正常脂质代谢[22]。本实验中GML 添加组血清TG、TC 和LDL-C 浓度均随GML添加水平的升高而降低，与对照组相比，HDLC 浓度则显著升高，说明GML 可能是通过降低LDL-C 的浓度来影响脂质转运过程，进而降低血清中TG 和TC 的浓度。这与Zhao 等[23]、刘梦芸等[9]和汪愈超等[6]的研究结果类似，他们发现饲料中添加GML 可以降低血清TG 和TC 水平。Wang和Kim[24]的研究结果与之相似，随着肉鸡饲粮中椰子油替代豆油的比例不断升高，血清中TC、LDL-C 的水平呈下降趋势。但蒋增良[25]报道，在小鼠日粮中加入低剂量的GML，增加了腹部脂肪、血清TG 浓度和LDL-C 浓度，并显著降低了HDL-C 浓度，高剂量却可以缓和这种不良效应。因此，GML 的添加量可以显著影响血清学指标的变化，适宜添加量的GML 能显著降低血脂，改善花鲈血清脂质代谢。

ALT 和AST 是反映机体肝功能的两个敏感指标。当肝脏受到各种因素的损害时，肝细胞通透性增加，ALT 和AST 就会渗透进入血液，导致血清中两者浓度增加[26]。因此，血清中ALT和AST 活性升高可表明其肝功能存在一定程度损伤。本实验中，拌喂GML 可以显著降低花鲈血清中ALT 和AST 活性，这与类似研究中添加GML 对蛋鸡的研究结果一致[14]。郭锡钦[27]报道，GML 在进入机体后，到达肠道被脂肪酶分解成月桂酸和甘油，最终在肝脏中被分解成二氧化碳和水，说明GML 不但对肝脏无毒副作用，还能明显改善花鲈的肝功能。但Wieland 等[28]在对初生奶牛的研究中却发现将栗子和GML 加入饲粮中，血清中AST 的活性无显著变化。笔者认为，出现上述差异的原因极大可能与GML 添加量有关。目前关于GML 对血清和肝功能影响的研究较少，其具体影响机理仍有待进一步研究。

图4 饲料中添加月桂酸单甘油酯对花鲈血清学指标的影响Figure 4 Effects of dietary GML level on serum biochemical indices of L.maculatus

3.3 GML 对花鲈抗氧化相关指标的影响

需氧生物在脂质代谢过程中会产生大量自由基，这也是机体过氧化损伤、代谢紊乱和抗氧化失衡的主要因素之一[29-30]。自由基的清除是机体内的抗氧化系统 (包括抗氧化酶系统和非抗氧化酶系统)在发挥功能[31]。SOD 和GSH-Px 属于抗氧化酶系统，与清除自由基功能密切相关，能保护重要的细胞大分子和细胞器免受氧化损伤；还原型谷胱甘肽属于非抗氧化酶系，作为GSH-Px 的反应底物，既参与GSH-Px 清除自由基途径，又直接与生物体内的氧自由基结合[32-33]。两者浓度升高可以有效缓解机体自由基生成和脂质过氧化，是体内酶促抗氧化体系的重要组成[34]。MDA 是自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应的最终代谢产物，其浓度高低反映细胞受损程度[35-36]。刘梦芸等[14]在GML 对蛋鸡抗氧化能力的影响研究中发现，GML 可以显著提高血清SOD 活性和GSHPx 浓度，并显著降低MDA 浓度。本研究结果与上述研究结果类似，拌喂GML 可以使花鲈肝脏中的SOD、GSH-Px 和GSH 水平显著升高，MDA 浓度显著降低。动物体在应激状态下，抗氧化酶活性降低，氧化代谢产物积累，机体自由基产生与清除失衡，从而引发氧化损伤。GML提高机体抗氧化能力的原因可能是：作为中链脂肪酸，GML 可以为花鲈供能，使得其他营养物质代谢耗能减少，线粒体产能和自由基生成量减少，机体氧化应激程度减轻，抗氧化能力得到恢复[37]。然而，尹彩娜等[38]研究表明，在小鼠日粮中添加椰子油能显著提高小鼠血清MDA 浓度，同时降低SOD 活性。导致以上研究结果不一致的原因可能与GML 的添加形式、添加量和实验对象种类不同有关。

图5 饲料中添加月桂酸单甘油酯对花鲈抗氧化能力的影响Figure 5 Effects of dietary GML level on liver hepatic antioxidative ability of L.maculatus

3.4 GML 对花鲈脂质代谢和肝脏组织形态的影响

肝脏是鱼类脂质代谢的主要场所，脂肪合成、分解、转运等代谢过程均在其中完成。肝脏中，FAS、ACC 和LPL 等的活性可以反映机体脂质代谢水平[39-40]。FAS 和ACC 是鱼类肝脏中脂肪酸合成代谢的关键酶，ACC 催化乙酰COA 形成丙二酰COA，FAS 催化乙酰COA 和丙二酰COA 合成脂肪酸，两者的高低可以反映机体脂肪酸的合成速度[41]。LPL 是脂质代谢过程中的关键限速酶，可以将血液中的乳糜微粒、极低密度脂蛋白中的TG分解为游离脂肪酸和甘油，从而降低血液中TC 水平[42]。以往研究表明，GML 可以提高脂质代谢酶活性，减少脂质沉积，改善脂质代谢。随着肉鸡饲粮中椰子油添加水平的升高，血清脂蛋白酯酶、肝酯酶和总脂肪酶活性均呈线性增加；在公牛饲料中添加椰子油，可增加其脂肪积累所需的时间；在断奶仔猪的日粮中同时添加椰子油和0.4%的GML，可显著改善其脂质代谢，且前期优于后期[24,43-44]。本研究结果与上述相似，GML 添加组花鲈肝脏FAS和ACC 活性下降，而LPL 活性显著增高，说明GML 提高了肝脏脂肪分解代谢酶活性，降低了脂肪合成酶水平，能够促进脂质代谢。结合肝脏组织形态观察发现，对照组肝脏中具有严重的脂质沉积和肝细胞空泡化现象，与之相比GML 添加组状况均有减轻，说明GML 确实具有一定的缓解脂质沉积的效果。此外，有研究表明持续性投喂添加剂GML 的效果要优于短期内高剂量投喂[45]。因此，长期投喂GML 是否能解决在养殖过程中脂肪肝的发生问题，仍需在后续研究中进一步确认。