益气化浊胶囊预防性给药对胰岛素抵抗大鼠肝脏的影响*

刘玉楠，李祥，闫冬雪，郭俊杰

山西省中医药研究院 山西太原 030012

胰岛素抵抗（IR）是指正常剂量的胰岛素无法发挥相应生物效应的一种病理状态。近年来多项研究表明，IR是2型糖尿病（T2DM）的核心机制并贯穿其发病始终。除此之外，它亦是肥胖、糖耐量异常（IGT）、血脂紊乱、动脉粥样硬化、高血压病等多种疾病的重要危险因素，会给个人及社会带来巨大的经济及心理负担[1]。众所周知，IR往往会伴发肝脏脂肪病变，进而影响肝脏功能受损，进一步加重IR，形成恶性循环。益气化浊胶囊是导师在前人基础上结合自身多年临床经验研制而成的院内制剂，前期实验[2-7]表明该药可有效防治IR，但缺乏该药对肝脏影响的相关研究，故本实验观察益气化浊胶囊预防性给药对高脂饮食胰岛素抵抗（IR）大鼠肝脏的影响，为该药的安全性及防治IR、T2DM的临床工作提供依据。

材料与方法

1 动物

SD大鼠，SPF级，雄性，6～8周 龄，体质量（220±20）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2014-0004，合格证号：1103221911001377；普通饲料、高脂饲料[8-9]（普通饲料78.9%，精炼猪油10.00%，蛋黄粉10.00%，胆固醇1.00%，猪胆盐0.10%）均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2014-0008，生产批号：20190124。

2 药物

盐酸二甲双胍片（规格：0.5g/片，中美上海施贵宝制药有限公司，批号：ABE4927）；益气化浊胶囊（规格：0.5g/片，山西省中医院制剂中心，批号：20190418）。

3 试剂

TG测定试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号：187951；TC测定试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司，批号：182041；大鼠胰岛素（INS）酶联免疫吸附测定试剂盒：伊莱瑞特生物科技有限公司，批号：NQ6THEXG2R。

4 仪器

电子天平：德国赛多利斯公司，型号：BP211D；微量血糖仪：美国强生公司，型号：稳豪倍优型；低速冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司，型号：KDC-1044；多功能微孔读板机酶标仪：美国Bio Tek公司，型号：Synergy H1；石蜡切片机：德国莱卡，型号：RM2016；电脑生物组织摊烤片机：浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号：KD-T；光学显微镜：日本OLYMPUS，型号：BX43。

5 方法

5.1 分组与给药 60只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分6组，每组10只。空白对照组，模型对照组，盐酸二甲双胍组（阳性对照组，简称二甲双胍组），益气化浊胶囊高剂量组（简称益气化浊高剂量组），益气化浊胶囊中剂量组（简称益气化浊中剂量组），益气化浊胶囊低剂量组（简称益气化浊低剂量组）。随即各实验组动物开始灌胃给药，1日1次，连续8周。根据《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表》计算实验动物灌胃量。空白对照组和模型对照组为10mL/kg·d 等容积生理盐水；二甲双胍组为0.2g/kg·d盐酸二甲双胍片；益气化浊高、中、低剂量组分别为2g/kg·d、 1g/kg·d、 0.5g/kg·d益气化浊胶囊。以上药物均按照70 kg成人每日每公斤体重服用药物剂量的6.3倍的等效剂量及其倍比剂量计算。

5.2 模型制备 给药同时造模，空白对照组普通饲料喂养；其余各组造模：高脂饲料喂养8周诱导IR大鼠模型。各组大鼠均自由摄食饮水，自然环境，明暗周期12h：12h。第8周末禁食不禁水过夜，空腹状态下测体重，以3ml/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血液6ml，离心取血清，供测量血清学指标使用；迅速解剖大鼠取得肝脏，大量预冷的生理盐水冲洗并用滤纸吸取多余水分，称量肝脏湿重，并在每只大鼠肝脏同部位剪取10g左右放入预先准备的10%多聚甲醛固定液中，为病理切片准备。

6 指标观测

6.1 体重、肝重、肝脏指数测定 电子天平称取体重、肝脏湿重；根据公式计算肝脏指数，肝脏指数（%）=（肝脏湿重量/处死时大鼠体重）×100%。

6.2 甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）水平测定 全自动生化仪测定血清TG、TC水平。

6.3 血糖（FPG）、血清胰岛素（FINS）水平测定及IR评价 快速血糖仪测得大鼠尾尖取血FPG；酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清FINS的水平，稳态模式评估法（HOMA-IR）评价IR水平，（HOMA-IR）=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5。

6.4 肝脏病理切片制备 肝脏切片HE染色，观察肝脏脂肪堆积情况。

7 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件，计量资料以（±s）表示，多组间比较则采用单因素方差分析（ANOVA），若方差齐性，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，则采用Dunnett'T3 多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠体重、肝重、肝脏指数比较

体重模型对照组显著高于空白对照组（P＜0.01），二甲双胍组、益气化浊高剂量组均显著低于模型对照组（P＜ 0.01）；肝重、肝脏指数模型对照组显著高于空白对照组（P＜0.01），二甲双胍组、益气化浊高剂量组、益气化浊中剂量组显著低于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

2 各组大鼠TG、TC水平比较

TG水平模型对照组显著高于空白对照组（P＜0.01），二甲双胍组、益气化浊高剂量组、益气化浊中剂量组显著低于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01）；TC水平模型对照组显著高于空白对照组（P＜0.01），各给药组与模型对照组相比未见显著差异，见表2。

3 各组大鼠FPG、血清FINS、IR水平比较

FPG水平各组间无统计学差异；FINS水平、HOMA-IR模型对照组显著高于空白对照组（P＜0.01），表明IR模型复制成功，二甲双胍组、益气化浊高剂量组、益气化浊中剂量组显著低于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01），表明益气化浊胶囊可以在一定程度上预防IR，见表3。

4 各组大鼠肝脏组织病理学观察

肉眼观察可见，空白对照组大鼠肝脏表面光滑，呈褐红色，质地柔软。模型对照组大鼠肝脏体积明显增大，颜色泛黄，质地较韧。各给药组情况居空白对照组与模型对照组之间，而各给药组间无明显差异。病理切片显示：空白对照组大鼠肝小叶结构清楚，肝细胞索呈放射状排列；模型对照组大鼠肝小叶结构破坏，大多数肝细胞肿胀，肝细胞出现明显的脂肪病变，胞浆内出现大量的脂肪空泡，部分细胞核被空泡挤至一侧。与模型对照组比较，各给药组大鼠肝细胞脂肪病变不同程度减轻，其中以二甲双胍组与益气化浊高剂量组减轻明显，见图1。

讨 论

肝脏作为IR的三大重要靶器官之首，其胰岛素受体相当密集，对胰岛素作用极为敏感，故先于其他组织发生IR，因此肝脏是研究IR的最为关键的器官。相关研究[10-11]表明IR与肝脏脂肪病变关系密切，相互影响，相互促进。长期高脂饮食摄入可引起内脏脂肪及其分解活性的增加，从使运送到肝脏的FFA增加，当进入肝细胞的FFA超过肝脏的氧化能力时，多余的脂质主要是以脂滴的形式存在，肝脏发生脂肪变性，最终导致肝脏IR[12]。肝脏IR发生时，一方面会使糖异生和肝糖输出增加，肝脏脂质含量升高，引发FPG升高、血脂异常；另一方面，影响胰岛素信号传导，IRS酪氨酸磷酸化减弱，P13K/Akt信号通路受阻，从而使胰岛素储存及利用葡萄糖的功能减弱，加重全身IR[13]。

中医学认为，肝脏脂肪病变多是饮食不节、过食肥甘之过，以致脾失健运，水湿不化，凝湿为痰，致痰湿气滞或痰浊血瘀，或日久生湿化热，致湿热血瘀，其本质为本虚标实，脾虚为本，痰湿、血瘀等实邪为标[14]。而益气化浊胶囊由黄芪、女贞子、苍术、丹参、鬼箭羽、黄精、蚕茧组成，正有益气养阴，活血化浊之效。现代药理研究[15-16]表明黄芪多糖作为黄芪主要生物活性成分，能够改善T2DM大鼠的IR及糖脂代谢紊乱。除此之外，黄芪有护肝作用[17]。女贞子、丹参、鬼箭羽、蚕茧、苍术、黄精[18-20]均能在不同程度上降血糖、降血脂、提高机体的免疫力。故中医基础理论与中药药理研究均为益气化浊胶囊预防性给药可有效改善肝脏脂肪病变奠定了基础。

表1 各组大鼠体重、肝重、肝脏指数比较（±s）

表1 各组大鼠体重、肝重、肝脏指数比较（±s）

组别 剂量/g·kg-1·d-1 体重/g 肝重/g 肝脏指数/%空白对照 - 417.00±15.39 9.78±0.9 2.29±0.19模型对照 - 468.50±31.66 13.67±1.22 3.01±0.07二甲双胍 0.2 422.40±18.23 10.08±1.17 2.52±0.18益气化浊高剂量 2 435.10±29.66 11.02±1.87 2.65±0.26益气化浊中剂量 1 446.400±28.23 12.15±1.27 2.85±0.13益气化浊低剂量 0.5 460.00±25.48 12.91±1.58 2.93±0.21

表2 各组大鼠TG、TC水平比较（±s）

表2 各组大鼠TG、TC水平比较（±s）

组别 剂量/g·kg-1·d-1 TG/mmol·L-1 TC/mmol·L-1空白对照 - 0.76±0.24 1.72±0.29模型对照 - 1.31±0.23 2.21±0.51二甲双胍 0.2 0.84±0.12 1.98±0.30益气化浊高剂量 2 0.84±0.12 1.91±0.38益气化浊中剂量 1 1.10±0.17 2.07±0.33益气化浊低剂量 0.5 1.17±0.22 2.15±0.27

表3 各组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR比较（±s）

表3 各组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR比较（±s）

组别 剂量/g·kg-1·d-1 FPG/mmol·L-1 FINS/mIU·L-1 HOMA-IR空白对照 - 4.75±0.43 20.80±2.74 4.40±0.76模型对照 - 5.03±0.58 50.37±7.86 11.24±2.06二甲双胍 0.2 4.76±0.48 31.29±4.45 6.57±0.70益气化浊高剂量 2 4.80±0.47 33.32±4.37 7.14±1.33益气化浊中剂量 1 4.89±0.52 38.46±4.08 8.38±1.44益气化浊低剂量 0.5 4.97±0.54 46.75±4.81 10.38±1.94

图1 6组大鼠肝脏病理组织学变化（HE染色，×200）

本研究采用高脂饮食诱导的方法复制IR模型。该造模方式具有省时、稳定的特点，是目前运用最广泛的方式之一[21]。实验结果表明，模型对照组大鼠具有IR伴肝脏脂肪病变的特点，而益气化浊胶囊可显著改善实验大鼠IR及肝脏脂肪病变，其中以益气化浊高剂量组改善最为显著。

综上所述，益气化浊胶囊预防性给药可明显改善高脂饮食诱导大鼠IR，改善肝脏脂肪病变，即对肝脏有一定的保护作用，为该药的应用安全性提供依据，为预防IR、T2DM奠定了一定基础。