从分子学角度探讨柴胡-郁金对卒中后抑郁潜在作用机制

张梓琪，高才植，殷晓莉

1 辽宁中医药大学 辽宁沈阳 110032

2 辽宁中医药大学附属第二医院 辽宁沈阳 110032

卒中后抑郁（Post-Stroke Depression，PSD）是发生于中风后的一种情感障碍，临床表现主要为情绪低落、思维迟缓、兴趣减退，早在1977年由Folstein等[1]首次提出脑卒中后继发抑郁的可能，目前发病机制尚不明确，主要有生物学机制和社会心理学机制这两方面解释。卒中后抑郁不仅影响了卒中患者的康复进程，还提高了卒中患者的致死率，给家庭社会造成极大的负担。中医学认为卒中后抑郁属于“郁证”范畴，属因病致郁，中药治疗在减轻患者症状、缩短病程方面发挥了相当的优势，且极大的减少了毒副作用，为卒中患者后续的康复治疗提供了保障。“柴胡-郁金”治疗卒中后抑郁有较好的疗效，且基于文献数据挖掘，统计出“柴胡-郁金”为近15年中药治疗PSD频次最多的药物，两者配伍可以加强调节脏腑气机升降出入的功能[2]。

柴胡[3]为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，按性状差异，分为“北柴胡”及“南柴胡”，味苦，性微寒，归胆、肝经，柴胡的主要成分为柴胡皂苷，药理作用有解热镇痛、抗炎、抗病毒、调节免疫系统、抗肿瘤等作用[4]；郁金[3]为姜科属，是温郁金、姜黄、蓬莪术、广西莪术的干燥块根，味辛、苦，性微寒，归肝、心、肺经，药理作用有调节脂质代谢、保肝利胆、调节血液循环、调节消化系统[5]。中医学以“整体观念、辨证论治”贯穿始终，中药作用于疾病更是多成分、多途径、多靶点，如何用更加科学的方法解释中药作用于疾病的机理，成为了中医药的研究热点[6]。网络药理学探讨的是相互之间关系网络，与中药作用疾病机理不谋而合。“网络药理学”的概念由Hopkins等于2007年提出[7]，是基于系统生物学理论，对生物系统进行的网络剖析，更强调从多途径对信号进行调节，揭示了“药物－基因－靶点－疾病”之间复杂的网络关系，从多维视角理解疾病的分子学机制，预测药理作用[8]。本文将从网络药理学角度探讨“柴胡-郁金”对卒中后抑郁的潜在分子作用机制，为后续卒中后抑郁的研究治疗提供有效帮助。

材料与方法

1 数据库及软件

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）、疾病靶点数据库（Genecards，https：//www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//www.omim.org/）、Cytoscape3.6.2软件、蛋白-蛋白相互作用平台数据库（String，https：//string-db.org/）、Venny绘图软件、富集分析metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/）。

2 药物靶点及活性成分筛选

将TCMSP数据库分别输入“柴胡”“郁金”，搜索得到各药化学成分，通过设置口服生物利用度OB（OB≥30%）及类药性DL（DL≥0.18）进行筛选，再结合文献搜集，将潜在的有效靶点整合一起。

3 疾病靶点收集

通过Genecards、OMIM软件，以疾病名称“Post-Stroke Depression”为检索词进行检索，将不同数据库的检索结果归纳在一起，得到PSD的靶标。

4 药物疾病靶点标准化及药物-靶点-疾病网络构建

将药物作用靶点（Target name）通过输入软件Uniport进行规范，添加symbol，同时将柴胡-郁金所有基因靶点与卒中后抑郁（PSD）基因靶点筛选后，通过Venny软件绘制出疾病和药物共同作用靶点图，将疾病药物共同作用靶点导入cytoscape3.7.2软件，通过R语言，绘制疾病-药物-成分-靶点网络图。

5 蛋白相互作用网络构建（PPI）

将筛选得到的药物和疾病的共同靶点上传到String平台，基因类型设置“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为0.7，其余参数不变，构建PPI网络图，展示出“柴胡-郁金”药对靶点蛋白与卒中后抑郁靶点蛋白之间的相互作用。

6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

将药物疾病共同靶点上传到metascape，物种选择“H.sapiens 36”，依次进行GO（gene ontology）分析和KEGG（pathway analysis）分析，P值设置＜0.01，筛选结果最终以条形图呈现[9]。

结 果

1 柴胡-郁金作用靶点及潜在有效成分

通过TCMSP筛选（OB≥30%、DL≥0.18）的到柴胡化学成分共17个，作用靶点276个，郁金的得到的化学成分15个，作用靶点60个，最后删除重复项，最终的到“柴胡-郁金”总共的化学成分为32个，作用靶点为190个。（化学成分见表1，由于结果较多，仅列出部分）

2 PSD疾病作用靶点

通过GeneCards（https：//www.genecards.org/cgibin/carddisp.pl）输入“Post-stroke Depression”筛选得到的疾病靶点为210个，通过OMIM得到疾病靶点为6个，删除重复，最终通过这两个数据库的到PSD疾病靶点为213个。

3 “柴胡-郁金”与PSD共同靶点以及疾病-靶点-药物网络图

将药物与疾病靶点通过Venny软件，绘制出韦恩图，得到共有靶点为36个（结果如图1所示）；将得到的标准化的共同靶点和化学成分导入cytoscape3.7.2中，绘制药物-成分-靶点-疾病图，见图2。图中内圈为有效成分，外圈为疾病、药物共同靶点，图中共有节点（nodes）47个，其中靶基因节点36个，成分节点8个，平均度值为4.1，度值反映了节点与节点相互连接的情况，根据度值高低排序，依次是槲皮素、柚皮素、山柰酚、β-谷固醇、异鼠李素、茵陈黄酮、豆甾醇、3，5，6，7-四甲氧基-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）色酮，度值排名前6位靶基因依次为PPARG、F7、CASP3、AKT1、PON1、CASP9。

表1 柴胡-郁金潜在活性成分

图1 药物疾病共同靶点韦恩图

4 PPI网络构建

将上过程得到的药物疾病共同靶点输入String，设置最低相互作用阈值为0.7，其余设置不变，得到药物-疾病的PPI网络，共有节点数36个，边数为139条，平均节点度为7.72，并将得到的tsv文件导入Cytoscape3.7.2，然后选择NetworkAnalyzer，得到图3，图中每一个节点相当于一个蛋白，节点大小、颜色亮度代表Degree的值，Degree值越大则节点越大，颜色越亮，边的宽度代表节点和节点相互作用的强度，边越宽，则节点之间互相作用越强。通过图3得到“柴胡-郁金”与PSD潜在核心蛋白是IL6、AKT1、VEGFA、CRP、CCL2、MMP9、SERPINE1。

5 GO生物学功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析

将药物疾病共同靶点导入Metascape，物种选择“homo sapiens”，选择个性化分析，设置P值＜0.01，最小计数为3，富集因子＞ 1.5，然后进行GO生物学功能富集分析，包括3部分，生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）分析[10]，如图4、5、6（仅列出部分，图中颜色根据P值着色，P值越高，颜色越深）。“柴胡-郁金”与PSD共有靶点的分子功能主要为细胞因子活性、内肽酶活性、蛋白酶结合、NADP绑定等；主要的生物学功能为调节细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应、对酸性化学物质的反应、调节对受伤的反应、对外部刺激反应的负面调节、对雌二醇的反应等；主要细胞组成为细胞外基质、血浆脂蛋白颗粒、膜筏、早期核内体等；KEGG代谢通路的分析主要系统分析了基因产物在细胞中的代谢途径，如图7所示，主要代谢途径为AGE-RAGE信号通路、弓形虫病、TNF信号通路、肿瘤中转录失调通路、血清素（5-HT）信号通路、NF-κB信号通路等。这可能为“柴胡-郁金”作用于PSD的关键通路。

图2 药物-成分-靶点-疾病图

图3 PPI网络图

图4 细胞组成

图5 分子功能

图6 生物学过程

讨 论

柴胡和郁金在临床上作为治疗卒中后抑郁经常出现的药物，具有疏肝解郁，调节人体气机升降的功能。有关药理学研究也证实“柴胡-郁金”内含有多种单体成分能够对抑郁起到治疗作用[11，12]。通过药物-成分-靶点-疾病图，得到柴胡潜在化合物为异鼠李素、茵陈黄酮、槲皮素、豆甾醇、3，5，6，7-四甲氧基-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）色酮，郁金潜在化合物为β-谷固醇、柚皮素。柴胡中的多种化合物属于黄酮类化合物，近些年随着人们对黄酮类化合物的研究，发现他对中枢系统具有显著影响，具有神经保护、抗抑郁、抗焦虑的作用[13]，N. SAMAD等[14]通过将槲皮素溶于25%乙醇溶液中，实验组抑郁小鼠予以注射，对照组只注射25%乙醇，研究结果表明槲皮素逆转了小鼠的应激引起的抑郁和焦虑；柚皮素属于类黄酮化合物，具有很强的抗氧化和抗炎作用，动物研究表明[15]柚皮素减少了小鼠静止时间，增加了社会探索偏好，表明具有抗抑郁的活性。柚皮素通过增强胆碱能传递、抗氧化防御系统、抑制脂质过氧化和亚硝化过程的机制，实现功能行为效应和神经精神疾病的预防。PPI网络中潜在核心靶点为IL6、AKT1、VEGFA、CRP、CCL2、MMP9、SERPINE1，IL6（白细胞介素-6）和CRP（C反应蛋白）同属于炎性细胞因子，有研究表明，卒中急性期炎性细胞因子水平增高，并且炎性细胞因子水平和PSD的发生率成正相关，提示IL6、CRP可能在卒中后抑郁的发病机制中起重要作用，而药物可能通过该靶点作用于疾病而起到治疗效果[16]。VEGFA（血管内皮生长因子A）属于神经营养因子（NF）家族中的一种，对神经细胞的再生以及神经系统的发育起着重要作用，可以诱导内皮细胞增生分化，进而促使新血管生成及侧支循环的建立[17]。AKT1属于AKT家族中的一员，属于蛋白激酶，是神经元存活的关键因子，有研究提出[18]AKT1基因参与调节人脑纹状体多巴胺信号的过程，可以猜测AKT1通过调节多巴胺的含量来影响情绪，但尚缺乏大量证据。CCL2属于趋化因子，因有使白细胞聚集的功能而得名，趋化因子的释放还可刺激释放炎症细胞因子，进而影响PSD的发生。

图7 KEGG代谢通路

GO生物过程提示“柴胡-郁金”靶点涉及炎性细胞因子信号通路、雌二醇的反应、上皮细胞凋亡、调节内皮细胞增殖等，这可能与卒中后抑郁发生的病理生理有关联。虽然卒中后抑郁的发病机制尚不明确，大量研究表明[19]，炎性刺激因子可能为重要危险因素，并且与PSD的发生成正相关；雌二醇是由卵巢成熟滤泡分泌的一种自然雌激素，而雌激素是有效的情绪调节器，能够调节5-HT的含量和保护神经，促进神经再生，起到抗抑郁作用[20]。KEGG代谢通路提示“柴胡-郁金”主要通过糖尿病并发症AGE-RAGE途径、肿瘤途径、血清素能途径等途径发挥作用，血清素（5-HT）是中枢神经系统的传递物质，在海马区内调节膜电位、兴奋性和抑制性突触传递，位于突触前膜的5-HT转运体通过再摄取突触间隙的5-HT而在代谢及功能精细调节中起关键作用[21]。由此可以猜测“柴胡-郁金”其中成分可能通过5-HT转运通路，来影响雌激素合成，进而起到治疗作用。AGE-RAGE[22]细胞通路中，AGE是细胞因子，RAGE是受体，AGE通过其受体RAGE发出信号以激活NF-kB细胞程序，NF-kB受到激活后进而影响TNF-α，IL-1、 IL-2、IL-6等从而产生炎症。

综上，“柴胡-郁金”对卒中后抑郁的治疗为多成分、多靶点、多通路，通过网络药理学发现靶点之间可以相互作用，而且许多靶点虽然度值非常低，也能起很大的作用，这为后来的研究提供了新的参考方向。