复方黄连灌肠液总生物碱含量测定研究

倪晓霞，刘晓玲，杨育儒，王庆芬

0 引 言

复方黄连灌肠液是我院消化内科协定处方制成的复方中药灌肠液，临床上用于治疗溃疡性结肠炎，效果显著。组方由黄连、白头翁、黄芪、甘草、山药等13味中药组成，方中君药黄连、白头翁及其他多味中药均含有生物碱类物质。现代药理学研究表明，生物碱类物质具有多种生物活性[1-4]，是重要有效成分，且生物碱含量与其作用功效之间存在正相关的量效关系。目前，总生物碱含量测定常用酸性染料比色法[5-6]与紫外分光光度法，但酸性染料比色法，操作繁琐，干扰因素多，重现性与结果准确性有待考量[7]。复方黄连灌肠液中总生物碱测定方法未见报道，为加强制剂质量控制，确保临床用药安全，本文参考有关文献[5-11]，建立柱色谱-紫外可见分光光度法测定复方黄连灌肠液中总生物碱含量，现报道如下。

1 仪器与试药

紫外可见分光光度计(UV-2550，岛津-苏州)，电子分析天平(AUW120D，岛津-日本)，华美冷柜(SY-176，杭州华美电冰箱厂)，数控超声波清洗器(KQ-250DB型，昆山市超声仪器有限公司)。

盐酸小糪碱对照品(贵州迪大生物科技有限责任公司，批号：633-65-8)；盐酸、甲醇、无水乙醇、乙腈、95%乙醇等均购自西陇化工股份有限公司，试剂均为分析纯；水为纯化水；复方黄连灌肠液(本院自制，批号：20190828、20190829、20190830)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制精密称取盐酸小糪碱对照品0.0101 g，置于25 mL量瓶中，加适量盐酸-甲醇(1∶100)溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.404 mg/mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加0.05 mol/L硫酸溶液溶解并稀释至刻度，即得80.8 μg/mL的盐酸小糪碱对照品溶液。

2.2 提取方法考察

2.2.1 直接提取法精密称取复方黄连灌肠液5.0 mL(批号：20190828、20190829、20190830)，每批次平行3份，置于50 mL量瓶中，加盐酸-甲醇(1∶100)溶液定容，摇匀，静置1.0 h，过滤，精密量取上述滤液5.0 mL，置中性氧化铝柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脱并定容至25 mL，摇匀，即得直接提取法供试液，精密量取供试液3.0 mL于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，以0.05 mol/L硫酸溶液为参比，于345 nm测定吸光度，见表1。

2.2.2 超声提取法精密称取复方黄连灌肠液5.0 mL(批号：20190828、20190829、20190830)，每批次平行3份，置于100 mL烧杯中，加盐酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，超声1 h(超声功率250 W)，过滤，滤液转移至50 mL量瓶中，用盐酸-甲醇(1∶100)溶液定容，精密量取上述滤液5.0 mL，置中性氧化铝柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脱并定容至25 mL，摇匀，即得超声提取法供试液，供试液按“2.2.1”项下方法测定吸光度，见表1。

2.2.3 水浴加热回流提取法精密称取复方黄连灌肠液5.0 mL(批号：20190828、20190829、20190830)，每批次平行3份，置于250 mL圆底烧瓶中，加盐酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，水浴加热回流1 h，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸-甲醇(1∶100)溶液定容至50 mL，精密量取上述滤液5 mL，置中性氧化铝柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脱并定容至25 mL，摇匀，即得水浴加热提取法供试液，供试液按“2.2.1”项下方法测定吸光度，见表1。

表1 复方黄连灌肠液总生物碱提取方法考察结果

结果表明，3批复方黄连灌肠液的供试液，超声提取法与水浴加热回流提取法的吸光度值明显高于直接提取法，且与超声提取法比较，水浴加热回流提取法供试液的吸光度差异具有统计学意义(P<0.05)。综合考虑选择水浴加热回流提取法作为供试液总生物碱的提取方法。

2.3 提取方法优化

2.3.1 提取溶剂考察精密称取复方黄连灌肠液5.0 mL(批号：20190828)，置于250 mL圆底烧瓶中，分别加入1%盐酸溶液、乙腈-1%乙酸溶液(80∶20)、65%乙醇溶液、85%乙醇溶液及盐酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，编号1至5组，每组平行3份，水浴加热回流1 h，冷却至室温，过滤，滤液用相应溶剂容至50 mL，分别精密量取上述滤液5 mL，置中性氧化铝柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脱并定容至25 mL，摇匀，即得各组供试液，供试液按“2.2.1”项下方法测定吸光度，平行测定3次，以平均吸光度为纵轴做图，见图1a。图谱提示，第1组、第5组供试液的吸光度大于其他溶剂提取组，且第5组(盐酸-甲醇(1∶100)溶液)显著高于第1组。

2.3.2 提取时间考察精密称取复方黄连灌肠液5.0 mL(批号：20190828)，置于250 mL圆底烧瓶中，分别加入盐酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，分别水浴加热回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，每组平行3份，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸-甲醇(1∶100)溶液定容至50 mL，分别精密量取上述滤液5 mL，置中性氧化铝柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脱并定容至25 mL，摇匀，即得各组供试液，供试液按“2.2.1”项下方法测定吸光度，平行测定3次，以平均吸光度为纵轴做图，见图1b。图谱提示，提取时间为1.5 h时，供试液吸光度值最大。

1：1%盐酸溶液；2：乙腈-1%乙酸溶液(80∶20)；3：65%乙醇溶液；4：85%乙醇溶液；5：盐酸-甲醇(1∶100)溶液

2.4 供试品溶液制备方法结合上述实验结果，综合考虑实验过程的高效性与经济效益，最终确定供试品溶液的制备方法：精密称取复方黄连灌肠液5.0 mL，置于250 mL圆底烧瓶中，加盐酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，水浴加热回流1.5 h，冷却至室温，过滤，滤液用盐酸-甲醇(1∶100)溶液定容至50 mL，精密量取上述滤液5 mL，置中性氧化铝柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脱并定容至25 mL，摇匀，即得。

2.5 含量测定方法建立与方法学验证

2.5.1 最佳吸收波长选择分别精密量取对照品溶液3.0 mL、供试品溶液5.0 mL(批号：20190828)，置于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，以0.05 mol/L硫酸溶液为空白，于200～600 nm范围内扫描，见图2。图示盐酸小糪碱对照品溶液在345 nm处有吸收峰；而供试品溶液的吸收峰略微红移在335 nm处，综合考虑，最后确定以345 nm为测定波长。

1：供试品溶液；2：盐酸小糪碱对照品溶液图2 复方黄连灌肠液紫外吸收光谱图

2.5.2 线性与回归方程分别精密量取盐酸小糪碱对照溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液定容至刻度，制备系列浓度对照品溶液；以0.05 mol/L硫酸溶液为参比溶液，于345 nm处波长处测定吸光度，以浓度(μg/mL)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线。计算得回归方程为：Y=0.17902X+0.0071(r=0.999 98)，表明盐酸小糪碱对照品浓度在1.616～19.392 μg/mL范围内与吸光度之间呈现良好的线性关系。

2.5.3 精密度试验精密称取盐酸小糪碱对照品溶液3.0 mL，置于25 mL量瓶中，平行6份，用0.05 mol/L硫酸溶液定容至刻度，并以0.05 mol/L硫酸溶液为参比，于345 nm处测定吸光度，以吸光度计算相对标准差(RSD)，结果RSD为0.364%(n=6)，表明精密度良好，见表2。

2.5.4 重复性试验取同一批复方黄连灌肠液(批号：20190828)，按“2.4”项下方法制备供试品溶液6份，分别精密称取供试品溶液3.0 mL，置于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液定容，并以0.05 mol/L硫酸溶液为参比，于345 nm处测定吸光度，以吸光度计算RSD%，结果RSD为0.389%(n=6)，表明供试品重复性良好，见表2。

2.5.5 稳定性试验精密量取供试品溶液(批号：20190828)3.0 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.5.4”项下方法测定，每隔10 min测定1次，以吸光度计算RSD为1.044%(n=6)，供试品溶液在60 min内稳定，见表2。

表2 复方黄连灌肠液中总生物碱含量测定方法精密度、重复性、稳定性试验结果(n=6)

2.5.6 加样回收率试验取同一批复方黄连灌肠液(批号：20190828，总生物碱含量为3.554 4 mg/mL)3.0 mL，置于250 mL圆底烧瓶中，分别加入盐酸小糪碱对照品溶液(0.948 mg/mL)9.0 mL，按“2.4”项下方法制备加样回收试验供试品溶液，平行制备6份，分别精密量取上述加样回收试验供试品溶液3.0 mL，按“2.5.4”项下方法测定，结果得平均回收率为100.86%，RSD为1.852%(n=6)，见表3。

表3 总生物碱含量测定方法加样回收率实验结果(n=6)

2.6 复方黄连灌肠液总生物碱含量测定取复方黄连灌肠液按“2.4”项下方法制备供试品溶液3批(批号：20190828、20190829、20190830)，分别精密量取供试品溶液3.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，0.05 mol/L硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，以0.05 mol/L硫酸溶液为参比，于345 nm测定吸光度，外标法计算总生物碱含量，见表4。

表4 复方黄连灌肠液中总生物碱含量测定结果(n=3)

3 讨 论

生物碱是存在于植物中具有最为显著活性的效部位成分具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗心血管疾病等作用[16]。目前的文献报道多是研究植物药材中总生物碱的提取与质量控制[7-9,12-15]，对于富含生物碱的制剂成品研究报道较少[16-17]，本研究建立柱色谱-紫外分光光度法测定复方黄连灌肠液中总生物碱含量的方法，并根据2015版《中国药典》对所建立的方法进行方法学验证，该方法具有简便快速、准确可靠等优点，可以作为复方黄连灌肠液中总生物碱含量测定及质量控制提供依据。

本研究参考有关文献，考察采用总生物碱提取常用的直接静置、超声以及水浴回流等方法提取复方黄连灌肠液中总生物碱，结果表明水浴回流提取法，提取比较完全，紫外吸收度值高于其他两种方法；再经过预实验确定进一步优化考察5种提取溶剂和5个回流时间后，综合考虑提取效果，最终确定提取方法为以盐酸-甲醇(1∶100)溶液为溶剂水浴加热回流1.5 h。

本研究考察最佳吸收波长时，盐酸小糪碱对照品溶液在228、263、345 nm处有吸收峰，而供试品溶液在279、335 nm处有强吸收，考虑是供试品溶液中其他成分对吸收峰位移的影响，并且在345 nm处供试品的吸收处于肩峰的位置，且波峰基线较平稳，峰形较好，最后确定345 nm 为测定波长。