miRNA-141通过调节TLR4信号通路抑制大鼠血栓形成*

冯琦 徐超 孙明慧

(新疆医科大学第五附属医院肾病科，新疆 乌鲁木齐 830011)

血栓形成是影响心血管健康的重要原因，血小板被活化后发生黏附和聚集是动脉血栓形成的关键因素[1]。目前，针对血栓已有大量集中于微小RNA(miRNA)作为诊断和治疗靶点的研究，并提出了有效的治疗方法[2]，如外周血单个核细胞miR-483-3p联合血浆D-二聚体检测可作为诊断下肢深静脉血栓的参考指标[3]。另外，血清miRNA-208与血小板活化密切相关，而且miRNA-208参与了血小板活化的调控[4]。研究表明血浆中循环的miRNA对血栓的诊断价值，并证实了它们与高凝性标志物的相关性[5]。Toll-like受体(TLR)是由10种不同的受体组成的家族，可识别病原体中的保守序列，主要受体被认为是Toll-like受体2(TLR2)和Toll-like受体4(TLR4)，其可诱导多种细胞因子的分泌并因此介导炎性反应[6]。多项研究已经探明TLR4信号对血管疾病和血栓治疗的重要性[7]。研究表明TLR4可被多种miRNA调控[8]。miR-141被发现可作为一种调节肿瘤血栓的潜在标志物[9]，与炎症调节密切相关的miR-141对血栓的调节和对TLR4信号的调控作用较少[10]。通过本研究，我们建立血栓大鼠模型并基于TLR4信号通路旨在探明miR-141的表达对血栓形成的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级别SD大鼠，雄性，体重178～231 g，购自新疆医科大学实验动物中心。本研究中涉及到的动物实验均通过我院伦理委员会审批通过。

1.2 试剂 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购于美国亚什兰BlanoseTM公司；阿司匹林购于上海复旦大学医药药剂科；6-酮-前列腺素F1(6-keto-PGF1)试剂盒，购于军事医学科学院同位素室；cGMP试剂盒购于上海中医药大学同位素室；NO试剂盒购于南京建成生物工程研究所。pcDNA3.1-TLR4重组质粒、miR-141的拟似物mimic、mimic的阴性对照(mimic-NC)均购买于上海吉玛生物科技有限公司。TLR4的一抗(ab13556)，兔抗NF-κB(ab101898)，兔抗Rsc1(ab155938)，兔抗IL-1β(ab106035)和兔抗GAPDH(ab9485)，IgG二抗(ab6721)均购买于美国Abcam公司。电化学发光(ECL)试剂购于南京碧云天生物科技公司。

1.3 实验分组和动物给药 90只SD雄性大鼠随机分组，其中10只为正常对照组；模型组使用5 g/L的CMC-Na建立大鼠动静脉旁路血栓模型(20只)；治疗组在CMC-Na基础上分别静脉注射100 mg/kg阿司匹林(Asp)作为阳性对照(10只)、miR-141的拟似物mimic(20只)、mimic阴性对照mimic-NC(10只)、mimic联合Toll样受体4(TLR4)过表达重组质粒pcDNA3.1-TLR4(mimic+pcDNA3.1-TLR4)(20只)。药物均用5 g/L的CMC-Na溶液制成混悬液，给药体积为10 mL/kg，静脉给药，每日1次连续4周。

1.4 颈动静脉旁路血栓模型 依据文献建立颈动静脉旁路血栓模型[11]。末次给药1 h后，大鼠进行颈动静脉旁路血栓形成实验。将大鼠麻醉(戊巴比妥钠30～40 mg/Kg，腹腔注射)，分离右颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管中段放入一根长6 cm的丝线，以肝素生理盐水溶液(50 Um/L)，充满聚乙烯管。当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后, 由聚乙烯管准确的注入肝素(50 μM/L)抗凝, 随后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉，开放血流15 min后中断血流，迅速取出丝线称重, 总重量减去丝线重量即得血栓重量。同时计算出血栓抑制率。血栓抑制率(%)=(模型血栓湿重-治疗组血栓湿重)/模型组血栓湿重×100%[12]。

1.5 血浆中NO，cGMP，PGI2水平的测定 取颈动静脉旁路血栓形成实验中的大鼠，下腔静脉取血1 mL，EDTA抗凝。按试剂盒说明采用放免法测定cGMP和PGI2，分光光度法测定NO。

1.6 体外血小板聚集实验 取给药大鼠，末次给药1 h后麻醉大鼠，腹主动脉取血0.5 mL, 肝素(20 μM/L)抗凝，分离富血小板血浆(PRP)，将PRP中血小板数调整为3×1011/L, 用改良Born比浊法测定血小板聚集性。取200 μL PRP，37℃温育5 min后，二磷酸腺苷组(ADP组)加入200 μmol/L的ADP 3 μL，mimic组为在血小板加入200 μmol/L ADP后并同时加入mimic，mimic-NC组为在血小板加入等量ADP并同时加入mimic-NC，加入记录5 min血小板的聚集曲线[13]。聚集抑制率按下列公式计算：血小板聚集抑制率(%)=(模型组最大聚集率-治疗组最大聚集率/模型最大聚集率)×100%[14]。

1.7 蛋白免疫印迹 将补充有液氮的大鼠静脉组织研磨为粉末，随后加入裂解缓冲液。4℃离心(1200 rpm)后，收集上清液。随后通过Bradford分析鉴定蛋白质浓度。随后将提取的蛋白质与2×上样量与蛋白质相同的上样缓冲液充分混合。将混合物在100℃加热5min后，使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)将蛋白质样品(20 μg/泳道)电泳分离。随后使用全湿法将蛋白质转移到PVDF膜上，在室温下，将PVDF膜在1×Tris缓冲液中用Tween 20孵育并密封45 min。兔抗TLR4的一抗(1∶1000)，兔抗NF-κB(1∶200)，兔抗Rsc1(1∶1000)，兔抗IL-1β(1∶2000)和兔抗GAPDH(1∶2500)加入到PVDF膜中，随后在4℃下孵育过夜。在使用TBST清洗3次(每次5 min)后，在PVDF膜上添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000)在室温下孵育2小时。TBST漂洗(每次洗涤5min)3次，随后使用增强的电化学发光(ECL)试剂(Beyotime Biotechnology，南京，中国)进行显色。将GAPDH设置为内参蛋白，目标条带与内参的灰度值之比代表蛋白的相对表达。

2 结果

2.1 miR-141对血栓模型的影响 miR-141的mimic组的血栓湿重与模型组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)。mimic组与模型组比较上调血浆中NO，PGI2水平(P<0.01和P<0.001)，mimic组提高血浆中cGMP水平(P<0.01)，差异均有统计学意义。阳性对照组的血栓湿重与模型组比较明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组与模型组比较上调血浆中NO，PGI2水平(P<0.05和P<0.05)，阳性对照组提高血浆中cGMP水平(P<0.01)，差异均有统计学意义。mimic与阳性对照组相比，mimic组的血栓湿重明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。mimic组上调血浆中NO，PGI2水平(P<0.05和P<0.05)，mimic组提高血浆中cGMP水平。差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、2。

表1 miR-141对大鼠动静脉旁路血栓的抑制作用

表2 miR-141对大鼠血浆中NO，PGI2，cGMP水平的影响

2.2 miR-141对体外血小板聚集的影响 过表达miR-141对血小板聚集的影响如表3所示，mimic组抑制由ADP诱导的血小板聚集，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 miR-141对ADP诱导的血小板凝聚的作用

2.3 miR-141对血栓模型大鼠颈静脉组织中TLR4信号的影响 与模型组比，miR-141的mimic组TLR4(P<0.01)，NF-κB(P<0.01)，Rac1(P<0.01)，IL-1β(P<0.01)的表达水平明显降低，差异有统计学意义；与模型组比，阳性对照组TLR4(P>0.05)，NF-κB(P>0.05)，Rac1(P>0.05)，IL-1β(P>0.05)的表达水平差异，差异无统计学意义，见图1。

2.4 过表达TLR4逆转miR-141对血栓的抑制 与mimic组比，mimic+pcDNA3.1-TLR4组的TLR4(P<0.05)，NF-κB(P<0.05)，Rac1(P<0.05)，IL-1β(P<0.05)的表达水平明显上调，差异有统计学意义，见图1；与mimic组比，mimic+pcDNA3.1-TLR4组的血栓湿重明显增加(P<0.05)，差异有统计学意义。与mimic组比，mimic+pcDNA3.1-TLR4组血浆中NO，PGI2水平下调(P<0.05和P<0.05)，与mimic组比，mimic+pcDNA3.1-TLR4组的血浆中cGMP水平下调，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 过表达TLR4逆转miR-141对血栓的抑制

图1 蛋白免疫印迹法检测miR-141对TLR4，NF-κB，Rac1，IL-1β的蛋白表达水平的影响

3 讨论

血管旁路血栓的形成及其并发症通常会增加住院患者的不良处境[15]。血栓形成发病机制涉及多种复杂因素，并且多种遗传因素已被证明与颈动静脉旁路血栓的形成和发展有关[16]。在我们的研究中，miR-141可以通过抑制TLR4信号通路来抑制抑制颈动静脉旁路血栓的形成。

通过使用生物学预测网站microRNA.org的预测分析发现miR-141可能与TLR4具有靶向调节关系。研究表明，TLR4已被证实直接被miR-21靶向抑制[17]，并且miR-335通过调节TLR4介导患的静脉血栓形成[18]。在先前的研究中，miR-141在3′UTR中靶向骨形成蛋白2并调节其表达，从而对成骨分化的调控[19]。而针对miR-141和TLR4之间关系的研究较少。

本研究发现miR-141下调颈动静脉旁路血栓的形成大鼠TLR4信号通路相关基因(NF-κB，Rac1和IL-1β)的表达。TLRs包含一类蛋白质，可以识别病原体相关分子模式(PAMPs)并激活宿主先天免疫的反应[20]，因此，多项研究聚焦于TLRs对癌和炎症的调节机制[21]。多项研究结果一致表明，动脉粥样硬化患者中TLR4的表达较高，而miR-146可以抑制动脉粥样硬化患者中TLR4信号的激活以及血管炎性损伤[22]。事实证明，TLR信号可以被miRNA调节，例如，在Jiang等人的先前研究中，miR-26a通过靶向大鼠巨噬细胞中的TLR3自身来负向调节TLR3信号，从而减轻了类风湿性关节炎[23]。本研究同样发现通过过表达miR-141，血栓大鼠血管组织中的TLR4表达显著下调。而且通过恢复TLR4的表达，NF-κB，Rac1和IL-1β的表达被恢复的同时，miR-141对血栓多项相关指标也被明显逆转。在Schattner等人的研究中，TLR4是心血管疾病血栓形成的关键调节蛋白[24]。因此，TLR4诱导的血管细胞炎症与血细胞的粘附相关，这可能是miR-141通过调节TLR4信号抑制血栓形成的关键机制。

此外，我们证明，与模型组相比，miR-141 mimic减少了血栓的湿重，但升高血浆中NO，PGI2，cGMP水平。血小板聚集在新的血栓形成中起重要作用[25]。血栓中较高的血小板数量可阻断血液通畅性并诱导血栓形成[26]。而且最新的研究同样表明miR-141能够抑制细胞的增殖和粘附[27-28]。另外，我们的实验不仅证实miR-141显著地抑制大鼠颈动静脉旁路血栓的形成，提高NO，cGMP，PGI2水平，抑制血小板聚集，而且发现miR-141 mimic的作用优于阿司匹林。目前已知NO，cGMP，PGI2都与血栓的形成有关。NO作为一种信使分子，具有抗血小板聚集，抗血小板和血细胞粘附作用。其作用机制是经NO/cGMP代谢通路，使血小板内cGMP升高，通过cGMP的第二信使作用，调节收缩蛋白质磷酸化水平，并使细胞内Ca2+水平降低，抑制血小板的聚集从而减少血栓的形成[29]。前列环素(PGI2)在心血管系统中具有保护作用，它能扩张血管，抑制血小板聚集，并可拮抗性减少血栓素的含量，而后者是已知最强的血小板聚集剂。PGI2与TXA2的比值对于心血管系统生理功能的稳定与调节至关重要[30-31]。本实验证实，过表达miR-141可以同时升高NO，cGMP，PGI2水平，通过影响NO/cGMP代谢通路及改变PGI2的水平而抑制血小板聚集，发挥抑制血栓形成作用。我们的研究结果为以后血栓治疗的靶向药物开发提供了实验依据。

4 结论

miR-141的过表达可以减少血栓形成，我们对机制研究表明，miR-141可通过抑制TLR4信号通路改善颈动静脉旁路血栓的形成。