基于LC-Q/TOF-MS技术分析特基拉芽胞杆菌发酵产物的功能成分

陈峥 刘波 史怀 陈梅春 陈倩倩 王阶平 邓文琼

摘 要：在微生物发酵床领域，特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis有良好的应用前景，分析该菌代谢产生的功能物质，为功能菌株的开发和利用提供理论基础。以1株分离自养猪发酵床的特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensisFJAT-49377为试验材料，运用LC-Q/TOF-MS技术检测其发酵产物，质谱数据经分子特征提取后，与Metlin数据库进行比对，从而获得代谢产物成分信息。结果表明：从特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensisFJAT-49377测定代谢产物24种，包括了脂肽类、鞘脂类、脂肪酸胺、抗生素和三肽等物质种类。其中，高匹配成分（匹配得分≥90分）有16种，包括二氢神经鞘氨醇、植物鞘氨醇、表面活性素、乌达霉素B等;在高匹配成分中，相对含量≥0.5%的成分有4种，分别为2，6二氨基7羟基壬二酸（匹配得分96.32分，相对含量1.01%）、

3氧代5S氨基己酸（匹配得分98.90分，相对含量0.88%）、表面活性素（匹配得分90.47分，相对含量0.86%）和胍基前克拉维胺（匹配得分91.69分，相对含量0.61%）。

关键词：特基拉芽胞杆菌;发酵产物;养猪发酵床;功能物质;液相色谱四级杆飞行时间质谱

中图分类号：S 432.45   文献标志码：A   文章編号：0253-2301（2021）12-0019-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.004

Analysis of the Functional Components of Fermentation Products ofBacillus Tequilensis by LC-Q/TOF-MS

CHEN Zheng， LIU Bo*， SHI Huai， CHEN Mei-Chun， CHEN Qian-Qian， WANG Jie-Ping， DENG Wen-Qiong

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： Bacillus tequilensis had good application prospect in the field of microbial fermentation bed. The analysis of the functional materials produced by the metabolism of this strain would provide theoretical basis for the development and utilization of functional strains. One strain of Bacillus tequilensis FJAT-49377 which was isolated from the fermentation bed for pig raising was used as the experimental material to detect the fermentation products by LC-Q/TOF-MS technology. After the extraction of molecular feature， the mass spectrometry data were compared with the Metlin database to obtain the component information of the metabolites. The results showed that 24 metabolites were determined from Bacillus tequilensis FJAT-49377， including lipopeptides， sphingolipids， fatty acid amines， antibiotics and tripeptides， among which there were 16 highly matched components （matching score≥90）， including dihydroneurosphine， phytosphingosine， surfactin， Udamycin B， etc. Among the highly matched components， there were 4 components with the relative content≥0.5 %， which were 2，6-diamino-7-hydroxy-nonadiic acid （matching score of 96.32 points， relative content of 1.01%）， 3-oxo-5S-amino-hexanoic acid （matching score of 98.90 points， relative content of 0.88%）， surfactin （matching score of 90.47 points， relative content of 0.86%）， and guanidine-precursor clavulanate （matching score of 91.69 points， relative content of 0.61%）.

Key words： Bacillus tequilensis; Fermentation products; Fermentation bed for pig raising; Functional material; Liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry

微生物发酵床（Microbial fermentation bed，MFB）利用垫料吸收畜禽排泄粪尿，通过垫料中的微生物进行原位发酵，达到分解消纳、去污除臭的效果，从而实现畜禽清洁、环保养殖[1]。微生物发酵床是微生物与垫料共同组成复杂的微生态环境[2]，微生物起到物质、能量转化作用，是发酵床良性运作的核心[3-4]。

学者通过高通量测序研究表明，芽胞杆菌是微生物发酵床中的优势种群[5]。芽胞杆菌具有益生、防病、除臭、降污、抗菌等生物活性，在微生物发酵床养殖领域中被广泛应用[6]。刘波等[7]研究了养猪微生物发酵床芽胞杆菌空间生态位特征，共鉴定出芽胞杆菌目6个科24个属种类。刘国红等[8]研究表明发酵床中芽胞杆菌含量达到4.41×108 cfu·g-1，芽胞杆菌属、类芽胞杆菌属、赖氨酸芽胞杆菌属为优势菌。其中，芽胞杆菌属的特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis较普遍地分布在发酵床的生境中[8-9]，在发酵床上具有良好的应用前景[10]。

研究前期，作者从养猪发酵床的生境中分离到1株特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensisFJAT-49377，具有耐高温的特性，并具备促进植物生长的活性[11]。该菌株在60℃温度胁迫下，仍保持较强的生长能力，活菌数达5.28×107 CFU·mL-1，同时该菌株能够分泌吲哚-3-乙酸（IAA），显著提高番茄种子发芽率。为了开发与利用该特基拉芽胞杆菌菌株资源，运用液相四级杆飞行时间质谱（LC-Q/TOF-MS）检测，采用非靶向性方法和Metlin数据库比对，结合文献报道研究其成分。本研究为进一步诠释发酵床原生菌对发酵床消纳粪污机制，为发酵床的健康运行提供理论指导，也为该活性菌株的开发与利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensisFJAT-49377，分离自福建省宁德市养猪场发酵床垫料，由福建省农业科学院生物资源研究所提供，采用-80℃甘油冷冻保存。

1.1.2 试验试剂 甲醇（色谱纯，美国杰帝贝柯公司），甲酸（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.1.3 供试培养基 LB固体培养基，LB液体培养基。

1.1.4 试验仪器 液相色谱四级杆飞行时间质谱联用仪Agilent 1260/6520（美国安捷伦科技公司）; 恒温培养振荡器ZHWY2102C（上海智城分析仪器制造有限公司）;电子天平AL104[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵产物提取方法 取出特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis FJAT-49377菌株，采用平板划线法活化菌种，挑取单菌落于LB培养基中，于30℃、170 r·min-1条件下培养48 h后得到發酵液。发酵液于8000 r·min-1离心10 min，去除菌体后取上清液，与等体积甲醇萃取2 h，12000 r·min-1离心5 min，取上清，用0.22 μm滤膜过滤后，置于进样瓶，于4℃冰箱保存，待检。

1.2.2 液相色谱质谱分析条件 色谱质谱条件： 色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18 （2.1×150 mm，1.8-micron）;柱温： 35℃;进样量： 2 ml;流动相A=0.1%甲酸+水;流动相B=甲醇;流速：0.3 ml·min-1;梯度洗脱程序：0 min、5%B;8 min、5%B;38 min、95%B;45 min、95%B;47 min、5%B;55 min、5%B。

质谱运行条件：正离子模式;干燥气温度：350℃，干燥气流速：8 L·min-1;雾化器压力：30 psig;毛细管电压：3500 V;裂解电压：175 V;Skimmer：65.0 V;质量范围：100～3000 m/z。

1.2.3 数据分析 得到数据后利用Agilent Mass Hunter工作站软件中的分子特征提取（MFE）工具提取并生成数据，经Metlin谱库检索后生成数据列表。高匹配成分筛选：以与metlin库的匹配得分为指标，筛选匹配得分（score）≥90分的成分，为高匹配（得分）的成分。高匹配成分、高含量成分筛选：从以上筛选出的高匹配成分中，筛选相对含量≥0.5%的成分，为高（相对）含量成分。

2 结果与分析

2.1 特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis FJAT-49377发酵产物检测

特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis FJAT-49377发酵产物的总离子流图见图1 。

2.2 特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis FJAT-49377发酵产物成分分析

由表1可知，特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis FJAT-49377发酵产物的质谱数据，通过分子特征提取（MFE）和Metlin谱库检索，初步鉴定结果成分有24种。这些成分包括：（1）脂肽类1种，为表面活性素（Surfactin）;（2）鞘脂类及衍生物3种，为植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、二氢神经鞘氨醇 （C16 Sphinganine）、Enigmol;（3）脂肪酸胺2种，硬脂酰胺 （Stearamide）和软脂酰胺（Palmitic amide）;（4）抗生素2种，为乌达霉素B（Urdamycin B）、双效菌素（Zwittermicin A）;（5）三肽类6种，为谷氨酸精氨酸精氨酸（Glu Arg Arg）、异亮氨酸天冬酰胺天冬酰胺（Ile Asn Asn）和脯氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺（Pro Gln Gln）等;（6）其他化合物10种，为2，6二氨基7羟基壬二酸（2，6-diamino-7-hydroxy-azelaic acid）、3氧代5S氨基己酸（3-oxo-5S-amino-hexanoic acid）和胍基前克拉维胺（Guanidinoproclavaminic acid）等。

2.3 特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis FJAT-49377发酵产物中高匹配成分分析

特基拉芽胞杆菌FJAT-49377发酵产物中，检出的高匹配成分（匹配得分≥90分）共16种，相对含量占总成分的5.41%（表2）。这些高匹配成分为二氢神经鞘氨醇（匹配得分97.98分）、植物鞘氨醇（匹配得分95.06分）、表面活性素（匹配得分90.47分）、乌达霉素B（匹配得分91.01分）和胍基前克拉维胺 （匹配得分90.47分）等。其中，匹配得分最高的为3氧代5S氨基己酸，匹配得分为98.90分，相对含量是0.88%。

2.4 特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis FJAT-49377发酵产物中高匹配、高含量成分分析

特基拉芽胞杆菌FJAT-49377发酵产物中高匹配（匹配得分≥90分）、高含量（相对含量≥0.5%）成分共4个，相对含量占总成分的3.36%（表3）。这些高匹配、高含量成分为：2，6二氨基7羟基壬二酸（匹配得分96.32分，相对含量1.01%）、3氧代5S氨基己酸（匹配得分98.90分，相对含量0.88%）、表面活性素（匹配得分90.47分，相对含量0.86%）和胍基前克拉维胺（匹配得分91.69分，相对含量0.61%）。

3 讨论与结论

特基拉芽胞杆菌具有重要的生物活性，广泛应用在农业生产领域。在作物种植方面，Ma等[12]发现特基拉芽胞杆菌具备杀线虫的活性，同时该菌还具有拮抗植物病原的特性，对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae[13]、青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum[14]、西瓜枯萎病Fusarium oxyporum[15]。在动物养殖方面，特别是在微生物发酵床养猪上，特基拉芽胞杆菌较普遍地分布在发酵床的生境中，在微生物发酵床上具有良好的应用前景[10]。刘国红等[8]统计了养猪微生物发酵床中芽胞杆菌的数量分布，结果表明特基拉芽胞杆菌为常见种群。陈倩倩等[9]从微生物发酵床猪舍空气中，分离到特基拉芽胞杆菌。特基拉芽胞杆菌具有的这些生物活性，与其分泌的代谢物密切相关。目前，对特基拉芽胞杆菌功能物质的研究还较少。如官颖[16]筛选到1株能抑制水稻稻瘟病和促进水稻生长的特基拉芽孢杆菌GYLH-1，提取其活性物质分子量为 292.8，推断该单一物质应该是一种未知的抗生素。陈倩倩[10]筛选了1株特基拉芽胞杆菌FJAT-14262，研究发现该菌能够产生surfactin类脂肽。

本研究对特基拉芽胞杆菌FJAT-49377的代谢产物进行了测定，检出成分包括了脂肽类、鞘脂类及衍生物、脂肪酸胺、抗生素及其组分、三肽等。结合文献报道，特基拉芽胞杆菌FJAT-49377的活性成分主要包括五类：（1）表面活性素（surfactin），也稱“抗菌脂肽”具有抗细菌、病毒和支原体作用。王晓青[17]研究表明，surfactin能明显抑制猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）。陈倩倩[10]筛选到1株产surfactin的特基拉芽胞杆菌FJAT-14262，对尖孢镰刀菌具有明显的抑菌活性;surfactin也应用在动物饲料，在饲料中添加surfactin可增强机体对脂肪的消化吸收，提高脂溶性维生素、类胡萝卜素和微量元素的吸收等[18];也有研究表明，断奶仔猪饲料中添加100 mg·kg-1水平的surfactin，可提高断奶仔猪生长性能[19]，降低断奶仔猪腹泻率[19]，改善血液生化指标[19]，改善肠道健康状况[20]，提高免疫功能[20]。（2）抗生素类，包括乌达霉素（Urdamycin）和双效菌素（Zwittermicin A）。乌达霉素是具有抗肿瘤作用的昂环素类抗生素，如乌达霉素A是弗氏链霉菌Streptomyces fradiae的主要产物，具有一定抗癌活性。双效菌素是由芽胞杆菌产生的广谱氨基多元醇类抗生素[21]，对卵菌、藻类、原生生物和多种G-和G+细菌均表现出一定的抑菌活性[22]。（3）鞘氨醇类，是重要的生物标记物，部分具有抗癌[23]和抗肿瘤[24]活性。田鹤[25]研究表明植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、二氢神经鞘氨醇（C16 Sphinganine）等为奶牛热应激诊断相关的可能生物标记物。高航[26]研究表明环境温度主要引起了生长猪脂肪代谢、碳水化合物和氨基酸的变化，其中涉及脂肪酸变化的小分子物质主要包括植物鞘氨醇、花生四烯酸、鞘磷脂等。李岩等[27]研究添加酵母菌对饲喂不同精粗比日粮肉牛血浆代谢组的影响，结果表明，当精粗比为30∶70时，酵母添加组的生物标志物为神经鞘氨醇、鞘氨醇和卵磷脂 （18∶0）。Enigmol是一种鞘氨醇碱类似物，具有潜在的抗癌活性，并被证实比使用结肠癌细胞系HT29细胞的天然鞘氨醇碱具有更高的细胞毒性和持久性[23]，也有实验证明，Enigmol在体外预防或逆转了不同阶段的小鼠卵巢表面上皮（MOSE）细胞的肿瘤进展[28]。（4）三肽化合物，与猪的营养密切相关，猪在肠道内对蛋白质的利用大部分是以三肽和二肽形式吸收的[29];另外，三肽对预防和治疗仔猪腹泻有一定的作用[28]。（5）其他化合物，如2，6二氨基7

羟基壬二酸：是抗菌肽伊短菌素Edeine B[30]、Edeine D[31]、Edeine F[32]的组分;而咪菌腈[2苯基2正丁基3（1H咪唑1）丙腈]，具有广谱内吸性杀菌活性，对于一些重要的禾谷类和园艺作物上多种难治真菌病害具有内吸杀菌活性[33];胍基前克拉维胺（Guanidinoproclavaminic acid）：与克拉维酸（Clavulanic acid，CA）的生物合成相关，能通过环化和脱氢生成克拉维酸，而克拉维酸是一种强大的不可逆β-内酰胺酶抑制剂[34]，如与阿莫西林同时应用时使得通过产生 β-内酰胺酶对阿莫西林耐药的大多数细菌重新成为敏感菌[35]，唐一鸣[36]测定大肠杆菌对21种抗菌药物的耐药性，结果表明，大肠杆菌对头孢噻肟/克拉维酸敏感性较高。

微生物发酵养猪的核心技术是利用其形成的有益功能微生物种群，长期和持续稳定地将猪粪尿进行降解。因此，以发酵床微生物为研究对象，特别是发酵床常见的微生物类群，研究其多样性与分布特性，分析其代谢产物，对于揭示发酵床对猪粪污降解、物质转化规律等具有重要意义。本研究以养猪发酵床中原位分离的特基拉芽胞杆菌FJAT-49377为研究对象，结合文献检索，对获得的代谢产物进行讨论，菌株代谢物中的表面活性素（surfactin）、乌达霉素（Urdamycin）、双效菌素（Zwittermicin A）等，具有细菌、病毒等活性;表面活性素（surfactin），可以提高动物的生长性能[19]，改善腸道健康[20]，提高免疫功能[20]的活性;三肽化合物，与猪的营养密切相关，影响猪对蛋白质的利用。而胍基前克拉维胺是重要β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸的前体。发酵床原位分离的芽胞杆菌，其代谢产物中包含了丰富的生物活性物质，有待进一步的开发和利用。本研究为进一步诠释发酵床原生菌对发酵床的作用机制提供理论依据，也为该活性菌株的开发与利用提供数据支持。而采用不同样本处理方式与检测方法来发掘活性物质，验证功能成分在发酵床中所起的作用，进一步明确物质转化和能量代谢的过程，还有待进一步研究。

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（责任编辑：柯文辉）

收稿日期：2021-11-05

作者简介：陈峥，男，1982年生，博士，助理研究员，主要从事微生物代谢物及功能研究。

通信作者：刘波，男，1957年生，博士，研究员，主要从事微生物生物技术与农业生物药物研究（E-mail：fzliubo@163.com）。

基金项目：福建省自然科学基金项目（2018J01036）;福建省农业科学院青年创新团队项目（CXTD2021010-3）。