1株产γ-氨基丁酸菌株的分离鉴定及发酵特性研究

陈国伟 贾娇 杜丹 解修超 耿敬章 邓百万

摘 要：对谢村黄酒酒曲中细菌进行分离，利用薄层层析法定性、柱前衍生高效液相色谱法定量筛选出1株产γ-氨基丁酸（Gama-aminobutyric，GABA）能力的菌株N1，通过对该菌株进行形态学观察、生理生化试验、16S rDNA序列分析鉴定，并绘制其生长曲线，研究谷氨酸钠（L-MSG）的添加量、发酵时间、发酵温度等对菌株N1发酵产GABA含量的影响。结果表明：经初筛得到的菌株N1，复筛测得发酵液中GABA含量为448.6 mg·L-1。结合形态学、生理生化及分子生物学鉴定菌株N1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，菌株N1在液体培养0～4 h处于延滞期，4～12 h处于指数期，12～16 h为稳定期，16 h之后为衰退期; 菌株N1最适培养条件为发酵时間72 h、发酵温度36℃、pH值6、接种量2%、装液量100 mL、谷氨酸钠添加量1%，在此条件下菌株N1发酵产GABA含量可达583.5 mg·L-1。

关键词：谢村黄酒酒曲;γ-氨基丁酸;分离鉴定;发酵特性

中图分类号：Q 93-331  文献标志码：A  文章编号：0253-2301（2021）12-0012-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.003

Isolation， Identification and Fermentation Characteristics of γ-aminobutyric acid-producing Strains

CHEN Guo-wei1， JIA Jiao1， DU Dan1，3， XIE Xiu-chao1，2*， GENG Jing-zhang1， DENG Bai-wan1，2

（1. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

3. Xianyang Academy of Agricultural Sciences， Xianyang， Shaanxi 712000， China）

Abstract： The bacteria in the yellow rice wine koji of Xiecun were isolated， and a strain N1 which was capable of producing γ-aminobutyric acid （GABA） was quantitatively screened by using the methods of thin layer chromatography and precolumn derivatization high performance liquid chromatography. The morphological observation， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence analysis and identification of the strain were carried out， and its growth curve was plotted， in order to study the effects of the addition amount of sodium glutamate （L-MSG）， fermentation time and temperature on the content of GABA produced by the strain N1. The results showed that the content of GABA in the fermentation broth was 448.6 mg·L-1 after the initial screening. Combined with the identification of morphology， physiology， biochemistry and molecular biology， the strain was identified as Bacillus subtilis. The strain was in the lag phase from 0 to 4 h after the liquid culture， the exponential phase from 4 to 12 h， the stable phase from 12 to 16 h， and the decline phase after 16 h. The optimum culture conditions for the strain N1 were as follows： fermentation time 72 h， fermentation temperature 36℃， pH value 6， inoculation amount 2%， liquid volume 100 mL， and sodium glutamate 1%. Under these conditions， the content of GABA produced by the strain N1 could reach 583.5 mg·L-1.

Key words： Yellow rice wine koji of Xiecun; γ-aminobutyric acid; Isolation and identification; Fermentation characteristics

黄酒（Huangjiu）源于中国，是世界三大酿造酒之一，被誉为“液体面包”[1-3]，具有悠久的文化历史，是我国古代礼仪的象征[4]。谢村黄酒产自陕西省汉中市洋县，起源于上古夏商时期，民间有“南有绍兴加饭，北有谢村黄酒”之说，谢村黄酒是一种具有营养保健功能的发酵型低酒精度酒，2010年已被纳入陕西省第一批非物质文化遗产[5]。据鉴定，谢村黄酒富含17种人体必需氨基酸，总含量高达115633.66 mg·L-1，比啤酒高11倍，比红葡萄酒高8倍，比绍兴加饭酒高出1倍多[6]。“曲为酒之骨”[7-8]，酒曲作为酒中产生各种风味物质的动力源泉，其中微生物起到重要作用，微生物之间存在着共生、互生、寄生、拮抗的作用，在麦曲传统制作工艺中，微生物逐渐形成一个复杂并与环境相适应的微生物区系，决定着黄酒的品质[9]。我国目前对黄酒研究仍然停留在生理效应和活性物质，对于酒曲研究主要集中于微生物产酶，功能活性成分γ-氨基丁酸（GABA）的研究较少，因此本研究对于黄酒中的新型功能因子GABA的研究有潜在应用价值。

γ-氨基丁酸（GABA）是非蛋白组织氨基酸，产生机理是由前体物质谷氨酸（L-glu）或谷氨酸钠（L-MSG）经谷氨酸脱羧酶（GAD）催化作用产而来，是动物神经中枢系统的主要抑制性递质[10]。GABA具有舒降血压、调节抗心律失常[11-12]、抗惊厥、镇痛[13-15]等功能。2009年被国家卫生部配准为新资源食品，成为研究的热门。谢广发等[16]研究发现我国的古越龙山绍兴黄酒中GABA含量达167～360 g·L-1;龚金炎等[17]从黄酒浸米液中筛选出产GABA植物乳杆菌，测得其发酵液中GABA浓度为1.02 g·L-1。本研究通过对谢村黄酒酒曲中分离的细菌，采用薄层层析法初筛定性和高效液相复筛定量，并对菌株N1进行鉴定及其发酵特性初步研究，探讨菌株N1在不同条件下的发酵能力，旨在为菌株N1用于生产GABA的研究提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料 黄酒酒曲，由陕西秦洋长生酒业有限公司提供。

1.1.2 仪器设备 电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，BSA8201）、生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司，SPX25085HH）、显微镜（上海普赫兴电科技有限公司，奥林巴斯CX22）、PCR扩增仪（上海恒久医疗器械有限公司，TA40英国Techne）、电泳仪（上海天能科技有限公司，TANOAEPS30）、高效液相色谱仪（广东科晓分析仪器公司，Agilent HPLC1220）。1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂15.0 g，pH自然，蒸馏水1000 mL。

发酵培养基：葡萄糖10.0 g、酵母膏10.0 g、蛋白胨5.0 g、硝酸钠3.0 g、七水硫酸镁0.02 g、硫酸锰0.001 g、氯化钠0.001 g、七水硫酸亚铁0.001 g、10 g L-MSG、pH 6.0。

其他培养基：甲基红试验培养基、V-P试验培养基等配制方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酒酒曲中细菌的分离 酒曲样本放在灭菌的研钵中粉碎，37℃、140 min振荡30 min，稀释涂布平板，37℃恒温培养。观察并挑取单菌落多次划线纯化，纯化后的平板备用，菌液于50%甘油Ep管保藏。

1.2.2 产GABA菌株的筛选

（1）产GABA菌株的初筛。薄层层析法测定见参考文献[19] 。①发酵培养：以3%的接种量转接100 mL（250 mL三角瓶）发酵培养基中，37℃、140 r·min-1摇瓶振荡发酵72 h。②发酵液处理：吸取2 mL发酵液于EP管，1000 r·min-1 4℃离心5 min，取上清液待测。③硅胶板的活化：硅胶板于烘箱105℃活化1.5 h，待用。④展开剂扩散层析缸：将展开剂倒入层析缸底部1 cm，盖上玻璃盖，静置1 h。⑤点样、层析、显色：以1 mg·mL-1 GABA标准液和L-MSG标准液为对照，取10 μL发酵上清液，迅速点样后吹干层析，待溶剂扩散至硅胶板上1～2 cm处取出，立即喷显色剂置于85℃烘箱显色15 min。

（2）产GABA菌株的复筛。PITC柱前衍生化法高效液相测定参照QB/T 4356-2012《黄酒中游离氨基酸的測定 高效液相色谱法》[20]。①发酵液处理：同薄层层析法的处理方法相同，得到发酵上清液即为样品原液。②样品衍生化、萃取、标准工作液衍生。③GABA标品波长扫描：配置不同梯度GABA标品液，衍生化后进行紫外分光光度计全波长扫描，确定最终检测波长。④色谱条件：检测波长为扫描波长。⑤标准工作液的配制。⑥测定：进样量10 μL，以峰面积为y轴，浓度为x轴绘制标准曲线。

1.2.3 产GABA菌株的鉴定

（1）形态学观察 观察37℃培养条件下的形态特征，包括边缘、颜色和透明度等，用革兰氏染色观察菌体形态和大小[21]。

（2）细菌生理生化试验 甲基红试验（M.R）、V-P试验、柠檬酸盐试验等参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]。

（3）分子生物学鉴定 水煮法提取细菌基因组，采用细菌通用引物1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）扩增目的片段，PCR扩增反应条件为：94℃预变性5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，33个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后测序，测序结果整理后提交进行BLAST比对，利用Mega 7.0构建系统发育树。

1.3 目标菌株的特性初步研究

1.3.1 目标菌株的生长曲线 经筛选鉴定得到的菌株为目标菌株N1，用无菌枪头取适量菌株N1接种于50 mL/250 mL的发酵培养基中，37℃、140 r·min-1条件下振荡培养，每2 h测定OD600值[22]，并绘制生长曲线。

1.3.2 发酵条件对目标菌株产GABA的影响

（1）谷氨酸钠（L-MSG）添加量对菌株N1发酵产GABA含量的影响 L-MSG是产生GABA的前体物质，取活化后的菌液分别接种于发酵培养基中培养，测定发酵液GABA含量，确定最佳添加量。

（2）发酵时间对菌株N1发酵产GABA含量的影响 将种子液按3%的接种量接种于最优谷氨酸钠添加量的基础培养基，37℃，140 r·min-1条件下振荡培养24、48、72、84、96 h，测定发酵液GABA含量，确定最佳发酵时间。

（3）发酵温度对菌株发酵N1产GABA含量的影响 将种子液接种于最优谷氨酸钠添加量的基础培养基，分别置于温度28℃、32℃、36℃、40℃、44℃条件下，140 r·min-1振荡培养72 h，测定发酵液GABA含量，确定最佳发酵温度。

（4）初始pH对菌株N1发酵产GABA含量的影响 将种子液接种于最优谷氨酸钠添加量的基础培养基，初始pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，140 r·min-1振荡培养72 h，测定发酵液GABA含量，确定最佳pH。

（5）装液量对菌株N1发酵产GABA含量的影响 将种子液接种于最优谷氨酸钠添加量的基础培养基，装液量为25、50、100、150、200、250 mL，140 r·min-1振荡培养72 h，测定发酵液GABA含量，确定最佳装液量。

（6）接种量对菌株N1发酵产GABA含量的影响 将种子液接种于最优谷氨酸钠添加量的基础培养基，接种量为1%、2%、3%、4%、5%，140 r·min-1振荡培养72 h，测定发酵液GABA含量，确定最佳接种量。

2 结果与分析

2.1 黄酒酒曲细菌分离

稀释涂布、划线法对黄酒酒曲样品进行单菌落分离，4℃平板保藏和50%甘油保藏，便于后续试验。

2.2 产GABA菌株N1筛选

2.2.1 产GABA菌株N1的初筛结果 菌株的发酵液离心后，进行薄层层析法初筛，其中N1菌株可利用1%L-MSG生成GABA（图1）。由图1可知，N1菌株发酵液与标液有一致的显色位置，显色较深，初步筛选出其具有产GABA的能力。

2.2.2 产GABA菌株N1的复筛结果 发酵液与标品GABA衍生化处理后，对衍生样品进行波长扫描，确定波长为254 nm，通过各浓度GABA衍生物测定结果比对分析，确定GABA保留时间为5.132 min，测定结果见图2和图3，以出峰面积为y轴，浓度为x轴，得到GABA浓度在0～80 μg·mL-1的标准曲线线性回归方程为y=12.522x-13.068（R2=0.9992），曲线有较好的线性相关关系。

通过比对发现，初筛菌株的发酵液样品在相同时间出现峰值。经计算发酵液中GABA含量为448.6 mg·L-1，将其确定为目标菌株进行后续特性研究。

2.3 产GABA目标菌株N1的鉴定

2.3.1 形态学特征鉴定 牛肉膏蛋白胨平板上生长的菌株表面褶皱无光泽，边缘微凸不整齐并向四周蔓延，颜色乳白色，湿润不透明，经革兰氏染色镜检为紫色短杆状，阳性杆菌（图4）。

2.3.2 生理生化试验鉴定结果 参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]对比试验结果，并结合形态学特征，初步鉴定N1为芽孢杆菌属，试验结果见表2。

2.3.3 分子生物学鉴定 以菌株N1总DNA为模板，经PCR扩增并检测合格后送至生工生物工程（上海）股份有限责任公司测序，并构建系统发育树（图5）。最终鉴定菌株N1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.4 菌株N1生长特性

由图6可知，菌株0～4 h为延滞期，4～12 h为指数期，12～16 h为稳定期且时间较短，16 h之后进入衰退期，70 h后大部分菌株死亡菌体释放，菌株在该培养基上有一定特异性，此后试验均以对数期为研究对象。

2.5 不同发酵条件对菌株N1发酵产GABA的影响

2.5.1 谷氨酸钠（L-MSG）添加量对菌株N1发酵产GABA含量的影响 前体L-MSG可在谷氨酸脱羧酶存在条件下催化生产GABA[23]。由圖7可知，添加0～4%的L-MSG发酵液均可产GABA，添加量为1%时GABA浓度最高，为538 mg·L-1，超过1%时会略有下降，不添加L-MSG的空白发酵液中有少量GABA，可能与基础培养基

成分有关。

2.5.2 发酵时间对菌株N1发酵产GABA含量的影响 发酵时间的长短直接影响微生物的代谢产物量。由图8可知，发酵72 h时GABA含量最高，此后略有下降，说明该菌株在稳定期和衰退期会产生酶催化前体物质合成GABA，故确定菌株N1的最佳发酵时间为72 h。并推测该酶为谷氨酸脱羧酶。

2.5.3 发酵温度对菌株N1发酵产GABA含量的影响 温度是影响微生物生长代谢的重要因素。由图9可知，N1菌株最适宜的发酵温度在 36～44℃，在此区间产GABA的能力较强，40℃时达到最大。因此，考虑后继试验条件将36℃作为发酵温度。

2.5.4 初始pH对菌株N1发酵产GABA含量的影响 初始pH不同的培养基会反应菌株对酸碱度的生长耐受情况。由图10可知，在pH 5.5～6.0，GABA含量随pH的升高而增加，pH 6.0时最高，为564 mg·L-1，之后随pH升高而降低，由于酒曲微生物实际所处环境偏弱酸性，因此推测菌株可在弱酸性环境稳定生产GABA。

2.5.5 装液量对菌株N1发酵产GABA含量的影响 不同微生物对氧气的需求量不同，对于需氧菌来说，溶氧量对发酵产物有着直接影响。以 250 mL 三角瓶中不同装液量来考察溶氧量对菌株N1发酵GABA的影响。由图11可知，随着装液量的增加GABA含量呈现先增加后减少的趋势，装液量为100 mL时GABA含量最大，为583.5 mg·L-1，溶氧量较少时对菌株生长产生影响，导致自身产酶较少，从而影响产GABA的能力。

2.5.6 接种量对菌株发酵产GABA含量的影响 接种量的多少可影响发酵液中的活菌量。由图12可知，随着接种量的增加发酵液中GABA含量先增加后减小，但接种量对GABA产量整体影响较小。因此，以2%接种量作为发酵培养基的最佳接种量。

3 结论

GABA作为新型功能因子，神经营养物质，具有降血压、治疗精神性疾病、促进睡眠等多种生理功能[24-25]。罗少华等[26]利用大肠杆菌制备γ-氨基丁酸并应用于工业化生产，但大肠杆菌会产生内毒素，在安全性方面存在争议。枯草芽孢杆菌是一种发酵过程中无内毒素产生的食品级微生物，获得美国FDA资格认证[27]，是酒曲中的优势菌，产蛋白酶和糖化酶优势明显并与黄酒风味物质密切相关[28]。因此，本研究利用枯草芽孢杆菌代谢生产GABA应用于黄酒和其他发酵食品行业的思路可行，研究并利用该微生物的特性，在后期生产富含GABA食品中具有潜在价值。

本研究通过从谢村黄酒酒曲中分离、筛选得到的1株产GABA能力的菌株N1，经初筛定性和复筛定量测得发酵液GABA含量达448.6 mg·L-1，经过形态学、生理生化试验、分子生物学鉴定确定菌株N1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;生长曲线表明该菌株在液体培养基0～4 h为延滞期，4～12 h为指数期，12～16 h为稳定期，16 h之后为衰退期。发酵特性试验结果显示，菌株N1最适发酵条件为pH 6.0、发酵温度37℃、装液量100 mL、发酵时间72 h，谷氨酸钠添加量1%，接种量2%。在此条件下菌株N1发酵液产GABA含量为583.5 mg·L-1。本试验结果表明，菌株N1不仅能直接发酵代谢生产富含GABA的黄酒，还能间接发酵代谢产酶促进GABA的生产，研究结果可为开发富含GABA黄酒或其他功能食品提供参考依据。

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（责任编辑：林玲娜）

收稿日期：2021-11-28

作者简介：陈国伟，男，1995年生，在读硕士研究生，主要从事微生物资源保育及应用开发研究。

通信作者：解修超，男，1982年生，博士，副教授，主要从事微生物资源开发与利用研究（E-mail：xiexiuchao@126.com）。

基金项目：陕西省重点研发计划（2019NY-134）;陕西省教育厅2020年服务地方专项科学研究计划（20JC010）。