养猪微生物发酵床垫料中大肠杆菌K88（Escherichia coli K88）生长动态分析

蓝江林 史怀 陈倩倩 刘波

藍江林 ，史怀，陈倩倩，等.养猪微生物发酵床垫料中大肠杆菌K88（Escherichia coli K88）生长动态分析[J].福建农业科技，2021，52（12）：01-06.

优秀学者论坛

蓝江林，1972年生，研究员，主要从事农业微生物的研究与应用。主持完成国家“863”计划项目（二级合同）、福建省自然科学基金等项目20余项，作为主要完成人参加国家公益性行业（农业）科研专项、福建省科技重大专项等项目20余项。获神农中华农业科技奖三等奖1项（排名第2），福建省科学技术进步奖二等奖1项（排名第4），福建省专利奖二等奖1项（排名第3），中国产学研合作创新与促进奖一等奖（排名第3）。以第一作者发表论文20多篇，其中获福建省自然科学优秀学术论文二等奖、三等奖各1篇。现任福建省农业科学院农业生物资源研究所副所长，兼任福建农林大学校外研究生导师、《福建农业学报》编委。

摘 要：为明确自然条件下养猪发酵床垫料对大肠杆菌生长的影响，探究大肠杆菌（Escherichia coli ）在垫料中的生长状况，采用人工接种方法，将绿色荧光蛋白（GFP）标记的大肠杆菌K88接种到养猪微生物发酵床垫料中;采用平板分离培养方法，观察大肠杆菌K88-GFP（Escherichia coli K88-GFP）在垫料中的生长动态。结果表明：E.coli K88-GFP在灭菌处理的新鲜垫料和使用1年的旧垫料中均能很好生长，分离培养168 h含量分别达到4.03×108 cfu·g-1和5.37×108 cfu·g-1，在数量级上无显著差别;而在未灭菌处理的新鲜垫料和使用1年旧垫料中均不能生长。说明在自然环境下，养猪微生物发酵床垫料对大肠杆菌K88的生长有抑制作用。

关键词：大肠杆菌K88GFP;微生物发酵床;动态模拟

中图分类号：S 828.5   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）12-0001-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.001

Analysis on the Growth Dynamics of Escherichia coli K88 in the Padding ofMicrobial Fermentation Bed for Pig Raising

LAN Jiang-lin， SHI Huai， CHEN Qian-qian， LIU Bo

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to clarify the effect of padding on the growth of Escherichia coli in the fermentation bed for pig raising under natural conditions， the growth of Escherichia coli in padding was studied. The green fluorescent protein （GFP）-labeled Escherichia coli K88 was inoculated into the padding of microbial fermentation bed for pig raising by using the method of artificial inoculation. The growth dynamics of Escherichia coli K88-GFP in the padding were observed by using the plate isolating culture method. The results showed that Escherichia coli K88-GFP could grow well both in the fresh padding with bactericidal treatment and the old padding used for one year， and the contents of Escherichia coli K88-GFP reached 4.03×108 cfu·g-1 and 5.37×108 cfu·g-1 after 168 h of isolating culture， respectively， with no significant difference in order of magnitudes. However， Escherichia coli K88-GFP could not grow in the fresh padding without bactericidal treatment and the old padding used for one year. The results indicated that the padding of microbial fermentation bed for pig raising could inhibit the growth of Escherichia coli K88 in the natural environment.

Key words： Escherichia coli K88-GFP; Microbial fermentation bed; Dynamic simulation

微生物发酵床养殖技术是采用谷壳、锯糠、椰壳粉等有机材料制成微生物发酵床垫料，吸纳养殖过程中畜禽排泄的粪尿，经过畜禽的踩踏，机械或人工翻扒，将畜禽排泄的粪尿与垫料充分混合，通过垫料中丰富的微生物进行发酵，将畜禽粪尿分解消纳，去污除臭，实现了养殖过程的清洁环保[1]。这一技术是养猪业环保发展的新模式，不仅能够实现粪污源头消纳，清洁环境，还能提高生猪机体抗病能力，减少疾病的发生，用后的垫料还可以作为生物基质等进行资源循环利用，是当前生猪养殖污染治理的主推技术之一[2-7]。在微生物发酵床养猪体系中，垫料是承载畜禽粪便的载体，垫料中丰富的微生物是降解畜禽粪便的核心，微生物的种类、活性与数量同时也是反映发酵舍环境健康状况的重要判定指标。而养殖过程中，最常见的环境污染微生物是肠道病原菌，其中，大肠杆菌和沙门氏菌的数量和动态则是反映环境卫生状况及群体健康动态的重要指标之一[8]。研究发现，与传统养猪相比，发酵床养猪出现疾病的情况明显减少，猪死亡率下降96%，可能的原因是微生物发酵床垫料形成的平衡稳定的微生物组不利于有害微生物的生长，有利于保持猪肠道健康，减少猪的肠道疾病[9-10]。也有研究表明，自然条件下，正常的发酵床垫料可以抑制大肠杆菌特别是携带毒素基因的大肠杆菌的生长，且对大肠杆菌的生防效果随发酵床使用时间的延长而增加

[11]。在垫料发酵级别为一级的垫料中，即垫料使用时间较短、发酵程度较低的条件下，可以分离到大肠杆菌;而在发酵程度较高的垫料中，即垫料发酵程度二级以上的环境中未分离到大肠杆菌[12-13]。说明在自然状态下，发酵床养殖环境可以显著抑制病原性大肠杆菌的数量[14]。

在以往的研究过程中，从猪舍采集的自然条件下垫料样品难以分离到大肠杆菌，为研究大肠杆菌在养猪微生物发酵床垫料中的生长动态，采用室内人工接种方法，模拟观察大肠杆菌在发酵床垫料中的生长状况。试验选用新鲜垫料和使用1年的垫料，采用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的大肠杆菌Escherichia coli菌株K88，以区别于垫料中自然环境携带的大肠杆菌。人工接种GFP 标记的E.coli-K88至灭菌和未灭菌处理的垫料中，观察大肠杆菌的生长状态，验证发酵床垫料对大肠杆菌的抑制作用，为发酵床养猪安全性研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜垫料：组成为谷壳∶锯糠=1∶1。

旧垫料：使用1年的垫料，采自福州新店养猪场。采样方法：发酵床面积3 m×3 m，垫料厚度80 cm，将垫料上层约40 cm的厚度翻耕均匀，随机5点采集垫料样品，每个样品1000 g，混合均匀，冷藏待用。

试验菌株：大肠杆菌K88-GFP（Escherichia coli K88-GFP）发酵液，浓度3.6×109 cfu·g-1。

1.2 养猪微生物发酵床垫料中可培养细菌的分离

采用牛肉膏蛋白胨培养基（NA）培养细菌[15]。取新鲜垫料和使用1年的旧垫料样品各200 g，分别置于500 mL无菌烧杯中，用3层无菌纱布封住杯口，于30℃恒温箱中培养，每24 h取样10 g，持续168 h，加入100 mL无菌水中，振荡15 min，使之充分混匀，梯度稀释至10-2、10-3、10-4、10-5。每个浓度平板涂布3块，每块平板涂布菌悬液200 uL。静置20 min，倒置于30℃恒温箱中培养24～48 h，统计菌落数量，计算对应细菌的含量。

1.3 养猪微生物发酵床垫料中大肠杆菌K88-GFP的生长动态分析

1.3.1 垫料灭菌处理 将垫料分装成5 L的小包，121℃高压灭菌，重复灭菌2次。灭菌后垫料采用无菌水稀释涂板培养，未长出任何微生物，则为灭菌完全。

1.3.2 人工接种大肠杆菌K88-GFP  试验处理见表1，每个处理设3个重复。

在超净台中，取各处理5 L置于体积7 L的无菌大塑料杯中，加入垫料体积比10%的大肠杆菌K88-GFP发酵液，用无菌水调节垫料湿度至40%～50%，混合均匀;用3层无菌纱布封住杯口，置30℃培养箱静置培养。每12 h取出，在超净台内上下翻动，保持湿度均匀。每24 h取样10 g，持续168 h;相同处理的重复样品混合均匀，取10 g，无菌水进行梯度稀释，采用伊红美兰+氨苄（Amp，100 μg%）抗性培养基涂板分离培养E.coli-K88-GFP。

1.4 试验数据处理

试验数据采用Excel 2010软件处理。

2 结果与分析

2.1 养猪微生物发酵床垫料中细菌的生长动态分析

由表2可知，培养24 h时，新鲜垫料中细菌的含量为1.12×108 cfu·g-1;随后，呈现不断上升的趋势，培养至120 h时，细菌的浓度达到最高值2.01×108 cfu·g-1;随后又呈现下降趋势，至168 h时，浓度为0.50×108 cfu·g-1。使用1年垫料中细菌的含量也呈现类似的变化趋势，培养24 h时细菌的含量为0.33×108 cfu·g-1;培养至120 h时，细菌的含量达到最高值1.41×108 cfu·g-1;随后下降，168 h时，含量为0.29×108 cfu·g-1。整个培养周期中，新鲜垫料的細菌平均含量显著高于（P<0.05）使用1年的旧垫料，说明自然条件下，随着垫料使用时间延长，发酵程度较高的垫料对细菌的生长存在抑制作用。

2.2 养猪微生物发酵床垫料中大肠杆菌K88-GFP的生长动态分析

2.2.1 未灭菌处理垫料中大肠杆菌K88-GFP的生长动态分析 人工接种后，采用伊红美兰+Amp抗性培养基分离到的细菌可确定为E.coli-K88-GFP。试验结果表明未灭菌处理的新鲜垫料和使用1年旧垫料中均未分离到E.coli-K88-GFP。说明未灭菌处理垫料即自然状态下的发酵床垫料对E.coli-K88-GFP的生长有抑制作用，接种的

E.coli-K88-GFP未能成功存活。

2.2.2 灭菌处理垫料中大肠杆菌K88-GFP的生长动态分析 由图1、图2可知，灭菌新鲜垫料+E.coli-K88-GFP处理分离的E.coli-K88-GFP数量总体呈现为先下降后上升的趋势;24 h时含量为4.48×108 cfu·g-1，至72 h时，降至最低1.07×108 cfu·g-1;随后，E.coli-K88-GFP的含量呈上升趋势，至144 h时，含量达到4.34×108 cfu·g-1;培养到168 h，最终含量为4.03×108 cfu·g-1。而未灭菌新鲜垫料+E.coli-K88-GFP处理（CK1）未检测到E.coli-K88-GFP。

灭菌旧垫料处理中，0～72 h时E.coli-K88-GFP含量呈不断上升趋势，含量从3.02×108 cfu·g-1上升至5.11×108 cfu·g-1;然后下降，96 h时含量最低2.00×108 cfu·g-1;96～168 h时含量再次呈现不断升高趋势，至168 h时，达到最高5.37×108 cfu·g-1。而未灭菌旧垫料未检测到E.coli-K88-GFP。

灭菌新鲜垫料+E.coli-K88-GFP和灭菌旧垫料+E.coli-K88-GFP两个处理的E.coli-K88-GFP含量总体无显著差异（P>0.05）。

3 结论与讨论

养猪微生物发酵床垫料中含有的微生物，数量多，种类丰富[16];其中细菌分布数量最大，在各使用时间和层次的分布量均达到107 cfu·g-1数量级以上，分布数量呈现随着垫料使用时间的增加先上升后下降的趋势[17]。王潇娣等[18]分离到细菌主要有大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、黏液性枯草芽孢杆菌、普通枯草芽孢杆菌等，通过小鼠致病性试验表明，黏液性枯草芽孢杆菌与普通枯草芽孢杆菌为有益菌。张庆宁等[19]分离获得的好氧细菌，经鉴定均为芽孢杆菌属不同的种。发酵试验和饲养试验表明，这些菌株在猪粪和垫料组成的发酵床生长优势强，耐发酵高热，能够产生多种与猪粪降解相关的酶类，除臭效果明显;对某些病原菌具有抑制作用，对猪安全并有促进生长的功能。且随着垫料使用时间的延长发酵床垫料理化性质不断变化，全氮、全磷、全钾、pH、电导率（EC）含量呈逐渐升高趋势，总菌数呈递减的趋势[20]。本试验的结果与之吻合，通过对垫料中的细菌进行分离培养，其含量达到107 cfu·g-1数量级，而新鲜的垫料细菌含量显著高于使用1年的旧垫料。说明自然条件下，随着垫料使用时间延长，发酵程度不断加深，垫料对细菌的生长存在抑制作用。

胡元庆等[14]检测微生物发酵床养禽基质垫料中病原性大肠杆菌和沙门氏菌的数量，发现发酵床基质中大肠杆菌和沙门氏菌病原微生物的数量明显低于普通饲养舍组，发酵床养殖环境中禽的肠道大肠杆菌和沙门氏菌的数量也低于普通养殖环境中动物体内携带的病原菌数量，说明发酵床养殖环境可以显著抑制病原微生物的繁殖。郑雪芳等[8]研究发现，垫料使用后期（第9个月）比使用初期（第1个月）大肠杆菌种群数量明顯减少，降低幅度在67.45%～96.53%，说明微生物发酵床能抑制大肠杆菌特别是携带毒素基因大肠杆菌的生长，且对大肠杆菌的生防效果随使用时间的延长而增加。说明微生物发酵床垫料中丰富的微生物能形成以有益微生物为优势菌群的生物保护屏障，阻止有害微生物的侵入，对致病菌的定殖产生抑制作用[1，11，21-24];而且发酵床养猪猪舍与传统猪舍相比，环境中和猪体表的菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌数均较少;发酵床养猪洁净卫生，为猪提供较好的生活环境[25]。本研究通过在垫料中人工接种大肠杆菌K88-GFP，也验证了自然条件下，微生物发酵床垫料环境的生防作用;结果表明，大肠杆菌K88-GFP在灭菌处理的新鲜垫料和旧垫料中均能很好生长，在未灭菌处理垫料中，微生物含量大，接种大肠杆菌K88-GFP均没有成功存活。说明在自然条件下，微生物发酵床垫料中丰富的微生物对大肠杆菌K88-GFP的生长具有抑制作用，能够提高对养猪健康环境的保障。

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（责任编辑：柯文辉）

收稿日期：2021-10-12

作者简介：蓝江林，女，1972年生，博士，研究员，主要从事农业微生物研究。

基金项目：福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项（2019R1034-2）。