2009—2018年辽宁省急性弛缓性麻痹监测中肠道病毒A组71型VP1区基因特征分析

任丽萍，邵玉平，陈涛，王艳，方兴，韩悦，姚文清

辽宁省疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110005

急性弛缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）病例定义为所有15岁以下出现AFP症状的病例及任何年龄临床诊断为脊髓灰质炎的病例均作为AFP病例。引起儿童AFP的病原除脊髓灰质炎病毒外，还包括肠道病毒A组71型（EV-A71）、柯萨奇病毒、埃可病毒等非脊髓灰质炎肠道病毒（non-polio enterovirus，NPEV）［1］。EV-A71 属小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）A 组肠道病毒［2］，该病毒除引起AFP外，还可引起手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎等［2］。近年来EV-A71多与手足口病的暴发相关，是引起手足口重症病例的病毒类型［3］。至2015年，EV-A71被分为7个基因型（A～G）和14个基因亚型［3-5］，其中，中国内地的C4基因亚型分为C4a及C4b 2个进化分支［4-5］。

本文对2009—2018年辽宁省AFP病例中EVA71分离株进行VP1基因特征分析，旨在为辽宁省AFP监测提供病原学依据。

1 材料与方法

1.1 标本 病例来自2009—2018年辽宁省AFP监测系统，14 d内的麻痹病例双份粪便标本由县区疾控中心采集，7 d内送至辽宁省疾控中心脊灰实验室，-20℃保存。

1.2 细胞及毒株 横纹肌肉瘤RD细胞及转脊灰病毒受体的小鼠肺L20B细胞均由中国疾病预防控制中心病毒病所脊灰实验室提供；EV-A71原型株（U22521_BrCr／1970／A）及EV-A71 C4亚型的C4a分支（FJ469153_BJ／CHN／2008／C4a）均从GenBank下载。

1.3 主要试剂及仪器 QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒、One Step RT-PCR Kit试剂盒及QIAquick Gel Extraction Kit胶纯化试剂盒均购自德国QIAGEN公司；Big Dye Terminator V3.0 Cycle Sequencing kit试剂盒及ABI3100测序仪均购自美国ABI公司。

1.4 病毒分离 根据WHO《脊髓灰质炎实验室手册》［1］及补充资料，用L20B细胞及RD细胞对粪便标本进行病毒分离，RD细胞呈阳性而L20B细胞呈阴性的为NPEV。

1.5 RT-PCR扩增 用QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒提取病毒RNA。引物为EV-A71特异性引物2386S 及 011［6］，上游引物 2386S：5′-CTATGAAGTTGTGTAAGGAT-3′；下游引物 011：5′-GCICCIGZYTGITGICCRAA-3′。用 QIAGEN One Step RT-PCR Kit试剂盒进行扩增。反应条件：42℃逆转录45 min，94 ℃ 3 min；94℃变性30 s，50℃退火25 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃ 10 min。

1.6 序列测定 PCR扩增产物用QIAquick Gel Extraction Kit胶纯化试剂盒纯化，用Big Dye Terminator V3.0 Cycle Sequencing kit试剂盒进行标记，ABI3100测序仪进行序列测定。

1.7 序列分析 使用BioEdit7.0.9.0软件对获得的EV-A71分离株与EV-A71原型株及C4亚型的C4a分支的VP1区进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。

1.8 基因进化树的构建及分析 根据序列分析获得的EV-A71分离株VP1编码区全长，从GenBank下载EV-A71各基因型及亚型代表株的核苷酸序列，以柯萨奇病毒A组16型（CVA16）原型株G-10为组外对照，用Neighbor-Joining方法构建所获分离株与EV-A71各基因型及亚型代表株的进化树，并用MEGA 4.0软件分析。

2 结果

2.1 病毒分离 2009—2018年辽宁省共检测1 044份AFP标本，99份标本中分离出NPEV，其中从11份标本中分离到EV-A71。11株分离株分别为EV7109-1／LN／CHN／2009、EV7112-1／LN／CHN／2012、EV7113-1／LN／CHN／2013、EV7113-2／LN／CHN／2013、EV7113-3／LN／CHN／2013、EV7114-1／LN／CHN／2014、EV7114-2／LN／CHN／2014、EV7114-3／LN／CHN／2014、EV7114-4／LN／CHN／2014、EV7114-5／LN／CHN／2014 及 EV7114-6／LN／CHN／2014。11株EV-A71分离株VP1区核酸扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见1 023 bp的目的条带，大小与预期均一致，见图1。

图1 11株EV-A71分离株VP1区核酸扩增电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of VP1 region of 11 EV-A71 isolates

2.2 同源性分析 EV-A71基因组全长7 408个核苷酸（BrCr／CA-70，U22521），VP1 编码区全长 891个核苷酸（2 439～3 329核苷酸）。11株分离株VP1区与C4亚型的C4a分支核苷酸同源性为96.5%～98.3%，氨基酸同源性为98.6%～99.3%；与EV-A71原型株核苷酸同源性为81.1%～82.2%，氨基酸同源性为93.6% ～94.7%；11株EV-A71 VP1区之间核苷酸及氨基酸同源性均较高，分别为95.5%～100%和98.6% ～100%。见表1。

表1 11株EV-A71、EV-A71原型株及EV-A71 C4亚型的C4a分支的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分析（%）Tab.1 Homologies of nucleotides and amino acids of VP1 regions of 11 EV-A71 isolates，EV-A71 prototype strains and clade C4a of EV-A71 subtype C4（%）

2.3 基因进化树分析 结果显示，辽宁省11株EVA71分离株与C4亚型的C4a分支处于同一支；11株分离株为密切相关的一簇，来源于同一传播链。其中辽宁省2009年分离株与山东2009年毒株相似性较高；辽宁省2012年分离株与福建2011年毒株相似性较高；辽宁省2013年的3株分离株分为2小簇，分别与浙江省和泰国的毒株相似；辽宁省2014年的6株分离株分为3小簇，分别与湖北、安徽、泰国的毒株相似性较高。见图2。

图2 辽宁省AFP病例中EV-A71分离株VP1区基因进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on VP1 regions of EV-A71 isolates from patients with AFP in Liaoning Province

3 讨论

EV-A71为A组肠道病毒的一个血清型，能引起儿童AFP，也是引起HFMD和疱疹性咽颊炎最常见的病毒［7-8］。根据肠道病毒划分原则，VP1基因同源性≥85%，EV-A71被分为A～G 7个基因型，B及C基因型是全球分布最广泛的基因型别。A基因型仅有EV-A71的原型株（BrCr株），1969年于美国发现；B、C基因型又分为B1～5、C1～5亚型，B及C基因型流行于欧美、亚太地区［9-11］。亚太地区流行的基因型2000年以前以B3、B4、C2为主，之后向B5、C3、C4基因型进化，近几年则以B5、C4基因型为主，C2基因型仅在日本流行［5］。印度在对本土HFMD及AFP病例中NPEV的回顾性研究中划分了D基因型，并鉴定了G基因型［7］。对非洲部分国家EVA71流行株的分析中，鉴定了E及F基因型［12］。中国将C4基因亚型划分为C4a和C4b两个进化分支；1998—2004年，以C4b流行为主，2005—2006年发生了C4a及C4b的共流行，2007年后C4a成为中国内地EV-A71绝对优势流行株［11,13-14］。

辽宁省此11例EV-A71相关的AFP病例中，临床诊断为病毒感染2例，感染性肌炎、急性播散性脑脊髓炎、胯关节滑膜炎、颈椎脊髓炎症、肌肉运动障碍、脑脊髓炎、疑似脑炎、小脑共济失调及非AFP各1例。分布时间上，2014年病例居多有6例，2013年有3例，2012年有1例，2009年有1例，2015—2017年未分离到EV-A71。本次分离的11株EVA71之间的核苷酸同源性较高，在95.5%以上；进化树分析也表明11个分离株为密切相关的一簇，同处于C4a进化分支，来源于同一传播链。

EV-A71侵袭中枢神经系统的途径与脊髓灰质炎病毒类似，可能涉及两种途径：血脑屏障传播或通过外周神经逆行轴突运输［15］。关于EV-A71感染引起的神经系统并发症机制研究较少，有研究报道，VP1蛋白97位亮氨酸变异为精氨酸（L97R）加强了EV-A71的神经向性［16］。本文分离的11株EV-A71 VP1蛋白的97位亮氨酸未变异为精氨酸。NOISUMDAENG等［17］研究发现，VP1 P710位置（VP1-145）由谷氨酸变为谷氨酰胺／甘氨酸／精氨酸时，会提高EV-A71对人的神经毒力，辽宁省11株分离株P710位置均为谷氨酸。本文主要对辽宁省EVA71分离株VP1区进行序列分析，5′非编码区序列毒力分析有待于进一步研究。

综上所述，本文分析了辽宁省AFP病例中EVA71分离株VP1区基因特征，为AFP监测提供了病原学依据。