一磷酸腺苷活化蛋白激酶／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白与自噬在非酒精性脂肪肝中作用的研究进展

钱子冰，曾佩芸综述，张琦，刘静审校

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院内分泌科，甘肃 兰州 730000

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）在世界范围内日益流行，是胰岛素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steato hepatitis，NASH）及肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要危险因素。因一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性在炎症、肥胖及糖尿病患者中降低［1］，因此，AMPK被认为是改善酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的一种可行的治疗策略。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是细胞生长和增殖的重要调节因子，AMPK／mTOR信号通路是调控自噬的主要信号通路之一。自噬不仅调节脂质代谢脏及胰岛素抵抗，且保护肝细胞免受损伤和细胞死亡。本文就AMPK／mTOR／自噬信号通路在NAFLD中的作用机制进行综述。

1 AMPK

1.1 AMPK亚基 哺乳动物AMPK为一种异三聚体复合物，由 α（α1 及 α2）、β（β1 及 β2）及 γ（γ1、γ2及γ3）亚基三部分构成，α-亚基是催化单元，其他亚基为调节单元，可表达12种不同的AMPK复合物，如 α1β1γ1、α2β1γ1 等［2-3］。通过 AMP 与 γ-亚基的变构结合或苏氨酸残基172（Thr172）的磷酸化激活α-亚基［4］，α-亚基编码一个 N-端蛋白激酶结构域（kinase domain，KD），该结构域与 C-端的调控结构域相连；β-亚基的C-端区域充当支架，与α-亚基及γ-亚基的C-端区域相互作用，β-亚基还包含一个碳水化合物结合模块（carbohydrate binding module，CBM）区域，又称为糖原结合域（glycogen binding domain，GBD。γ-亚基含4个胱硫氨酸-b-合成酶结构域（cystathionine-β-synthase，CBS），参与核苷酸合成，这种现象已在γ2（人类）及γ3（猪）亚型的自然突变基因中得到证实［5］。γ-亚基的突变导致AMPK活性增加，为在体内长期激活AMPK做好了准备。人类在γ2中发现了一些显性遗传突变，这些突变可导致严重的心脏功能异常，包括左心室肥厚、糖原积累及心室预兴奋（Wolff-Parkinson-White综合征），也可能导致心脏性猝死［6-7］。人类γ2在心脏中高表达，而γ3几乎仅在骨骼肌中表达［8］。因此，了解物种中AMPK亚基的表达模式至关重要。

1.2 AMPK调控 AMPK通过 Thr172在 α-亚基KD激活段的磷酸化而激活，哺乳动物中钙／钙调节蛋白依赖性蛋白激酶（Ca2+／calmodulin-dependent protein kinase kinase，CaMKK）β 及肝脏激酶 B1（liver kinase B1，LKB1）被确定为AMPK的两种上游激酶［9-10］。Thr172的磷酸化使AMPK活性增加2～3个数量级，AMP／ADP降低了Thr172去磷酸化率［11］。此外，一些小分子的AMPK直接激活剂已被鉴定，如A769662、991及MT63-78，它们结合在KD和β-亚基CBM之间，这些小分子直接激活剂可防止Thr172去磷酸化［12］。AMPK可通过AMP与γ-亚基结合或通过小分子激活剂进一步被变构激活［12］。在多数情况下，变构激活的程度取决于AMPK复合物的组成，而在AMP充足的情况下，也受ATP浓度的影响［13-14］。有研究报道，核苷酸可促进Thr172磷酸化，尽管这方面的调节仍存在争议。一项研究报告称，AMP及二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）均促进了CaMKK β对Thr172的磷酸化［15］；另一项研究表明，AMP通过LKB1激活，不被ADP及CaMKK β激活［16］。这些作用的分子机制尚不清楚，尽管一项单独的研究报道了AMP促进AMPK、LKB1及轴蛋白之间的相互作用，通过促进AMPK与LKB1之间相互作用，轴蛋白可促进AMP增加Thr172磷酸化的机制［17］。另一项研究检测了Thr172和S108（β1上一个自磷酸化位点）磷酸化对AMPK活性的要求，结果表明，在无Thr172磷酸化的情况下，A769662激活了AMPK，其活性水平与Thr172磷酸化的AMPK相似［18］。A769662激活非Thr172磷酸化的AMPK需β1上S108的磷酸化，S108突变使丙氨酸显著降低了A769662刺激AMPK的能力［19］。这些发现表明，AMPK的激活在完全无Thr172及S108磷酸化的情况下，仅通过变构激活便可发生［18］。这可能意味着Thr172或β1中S108的磷酸化与AMPK活性调节无关，同时表明细胞及体内AMPK的激活与Thr172磷酸化的增加有关。但并不是AMPK的变构激活不重要，在大多数情况下，AMPK的变构激活伴随着Thr172磷酸化的增加。

2 mTOR

2.1 mTOR mTOR是PI3K相关激酶（phosphatidy linositol 3-kinase，PIKK）家族中一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，由2 549个氨基酸组成，包括多个功能及调节结构域。mTOR可通过不同相对独立的结构域招募多个伴侣，形成2个不同的信号复合物：mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2）［19］。mTOR的机制靶点是调节自噬的核心枢纽，受不同上游信号通路调控自噬。mTOR的3条上游信号通路包括PI3K／蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信号通路、AMPK信号通路及RAS／Raf／MEK／ERK信号通路［20］。这些通路可通过调节mTOR相应地抑制或增强自噬水平。因此，调节mTOR的不同上游信号通路可能是治疗肝损伤的新研究思路。

2.2 mTORC1及mTORC2mTORC1及mTORC2复合物具有特定的底物偏好，可触发不同的下游信号事件来调节细胞功能。mTORC1由3种核心成分（mTOR、Raptor、mLST8）和 2个抑制亚基（PRAS40、Deptor）组成，主要功能是调节细胞生长及代谢，整合多种刺激及信号网络来促进新陈代谢［21］。mTORC1可通过直接磷酸化2种关键底物促进蛋白质的合成，如磷酸化70 000核糖体蛋白S6激酶1（phosp-horylated 70 ribosomal protein S6 kinase 1，p70S6K1）及真核翻译起始因子4E结合蛋白（4E binding protein，4EBP）。mTORC2由 4种核心成分（mTOR、Rictor、mLST8、mSIN1）和 1 个抑制性亚基 Deptor组成，主要通过磷酸化蛋白激酶A、G及C（AGC）家族的几个成员来控制细胞的增殖、存活、离子转运及骨架重塑［22］。如mTORC2可磷酸化蛋白激酶C（PKCα、PKCδ、PKCζ、PKCγ 及 PKCε）以调节细胞骨架重塑及细胞迁移［19］。此外，mTORC2还可磷酸化并激活血清／糖皮质激素调节激酶1（serum／glucocorticoid regulated kinase 1，SGK1），调节离子转运及细胞存活［23］。与mTORC1比较，对mTORC2通路了解较少，仅知其上游激活因子是生长因子／PI3K信号轴。研究表明，PI3K信号可能通过促进mTORC2与核糖体的结合而激活mTORC2，但核糖体结合如何激活mTORC2的机制还需进一步研究［23］。

3 自噬

自噬最初在肝脏实验中被发现，为一种降解受损的细胞器或蛋白质聚集的细胞过程。在基础条件下，所有细胞的自噬水平均较低，且可被不同形式的压力进一步诱导，如营养或饥饿、生长因子耗尽、感染及缺氧。该过程使细胞从各种应激状态中解放出来，是应激刺激下细胞存活的一种机制［19］。目前已知自噬失调可引起许多肝病，因此如何正确调节自噬是治疗肝病的关键。自噬是细胞降解和代谢自身成分的过程，分为非选择性自噬及选择性自噬［18］。非选择性自噬用于饥饿条件下大量细胞质的周转，而选择性自噬则专门针对受损或多余的细胞器，包括受损的线粒体、不需要的过氧化物酶体、多余的核糖体、脂滴及侵入性微生物。同时，自噬为一种溶酶体降解过程，调节细胞器及蛋白质的稳态。作为细胞管家，自噬在肝脏中的功能主要分两方面［19］：一方面，自噬通过消除肝脏相关疾病中引入的受损细胞器及蛋白质避免细胞损失及死亡；另一方面，在不同的条件下，自噬可促进肝脏损伤的进一步恶化（如过度自噬可导致肝细胞死亡；肝星状细胞自噬增加可促进其活化，加重肝纤维化）［20］。但自噬在NAFLD中如何进行选择性的调节有待进一步研究。

4 AMPK／mTOR／自噬信号通路

LKB1及CAMKK β等上游激酶作为AMPK的重要激活位点，可通过磷酸化Thr172直接激活AMPK［24］。激活的AMPK通过两种互补作用维持能量平衡，即抑制多细胞生物的多种合成途径，如脂质、蛋白质及碳水化合物生物合成，同时激活各种分解代谢过程，如葡萄糖代谢及自噬［25］。mTOR为一种营养敏感的激酶［26］，在营养丰富的条件下，mTORC1整合各种刺激及信号，促进蛋白质、脂类及核苷酸的合成，同时阻断代谢分解过程，如抑制自噬，促进细胞生长及增殖［27］，这与AMPK的作用正相反。因此，在能源短缺条件下，mTOR是AMPK的重要下游靶点。此外，AMPK还能维持能量平衡，通过抑制mTOR对自噬的调节，从而在治疗一些肝脏损伤中发挥至关重要的作用。值得注意的是，自噬不仅是mTOR重要的下游调控机制，且在AMPK维持能量平衡的过程中也起关键作用。UNC-51样激酶1（ULK1）是自噬启动和发展的重要调控因子，而mTOR是ULK1的上游负调控因子。研究表明，AMPK通过AMPK／mTOR途径间接激活ULK1的自噬。一方面，AMPK通过激活mTORC1及结节性硬化复合物蛋白2（tuberous sclerosis complex-2，TCS2）的负调节因子抑制mTOR的活性；另一方面，AMPK通过抑制mTORC1的主要亚基Raptor来抑制mTOR的活性［28］。通过以上两方面的作用，mTOR对ULK1的抑制作用被释放，最终激活自噬作用。此外，AMPK还可直接激活ULK1或直接磷酸化ATG9、VPS34及Beclin-1等自噬核心成分，促进自噬［29］。

5 NAFLD

NAFLD是全球最常见的慢性肝病，与肥胖、高脂血症及糖尿病密切相关，NAFLD的社区患病率从20世纪80年代小于10%上升至目前15% ～30%［30］。NAFLD患者肝脏组织表现出明显的脂肪变性、肝脏炎症甚至肝细胞坏死，肝脏脂肪变性进一步发展将危及生命，如肝硬化、肝细胞癌及肝功能衰竭等［18］。NAFLD肝脏组织学表现为：①当脂肪≥5%的实质受累时，最初为单纯脂肪变性或脂肪肝；②脂肪性肝炎、小叶性炎症、肝细胞球囊和／或Mallory-Denk的生成；③脂肪性肝炎合并肝纤维化，一旦胶原沉积在肝实质，首先以小叶中心或肝窦周围发生，随后门脉纤维化；④肝硬化（当纤维化将肝细胞包裹并分离成结节时）；⑤晚期肝病（当门静脉高压和／或肝细胞癌并发症发生时）［30］。NAFLD还与心血管疾病、代谢综合征、非肝及肝细胞恶性肿瘤的发病率增加有关，早期对NAFLD患者进行分层，并定期跟踪患者进行再分层，对于预测和管理NAFLD并发症具有重要意义。

6 NAFLD与AMPK／mTOR／自噬信号通路

NAFLD治疗方案的一个共同特点是激活AMPK［1］。实际上AMPK的激活与多种代谢改善有关，可能在介导各种药物／营养物质有益作用方面起至关重要的作用。在肥胖人群中，脂肪组织AMPK活性的降低与全身胰岛素抵抗有关，表明脂肪组织AMPK活性水平可能与NAFLD的发生发展相关［31］。利拉鲁肽（Liraglutide，LRG）及含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白 5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，FNDC5）可通过诱导自噬来改善肝脏脂肪变性和减少肝脏脂质积累［32］。相反，高脂饮食或脂质的长期积累可能降低自噬活性［33］。在NAFLD中，脂质积累、高胰岛素血症、内质网应激及细胞因子表达降低被证明会导致肝自噬缺乏［34］。研究表明，脂肪吞噬是自噬参与调节肝脏脂质代谢的主要机制，增加AMPK活性被认为是改善NAFLD的可行性治疗策略之一［18］。有研究提出，在开发AMPK激活剂治疗NAFLD时，重要的是应避免中心通路中AMPK的慢性激活，因这种作用可能导致肥胖［35］。SMITH总结了AMPK在影响NAFLD中3种主要机制［31］：①抑制肝脏新生脂肪生成；②增加肝脏脂肪酸的氧化；③保护脂肪组织线粒体功能。研究发现，对乙酰氨基酚的治疗剂量可加重NAFLD的脂肪积累，其潜在机制可能与抑制AMPK／mTOR通路进而抑制自噬有关［36］。ZHANG 等［37］研究发现，AMPK／mTOR介导的自噬水平在高脂喂养的小鼠及游离脂肪酸处理的LO2细胞（人正常肝细胞）中均有明显抑制作用，当 Ghrelino-酰基转移酶（GOAT）被抑制时，AMPK／mTOR介导的自噬水平显著升高，从而减轻肝脏毒性。据报道，硫化氢（H2S）对NAFLD有治疗作用，其作用机制是通过激活AMPK／mTOR介导的自噬作用于 AMPK α2［38］。因此，推测激活 AMPK／mTOR介导的自噬是治疗NAFLD的一种新兴方法。目前已确定了几种药物可恢复NAFLD自噬通量的能力［39-40］。如肝癌发生尚未开始，这些药物可能是有希望预防NALFD相关肝癌的方法。但这些药物的临床应用仍有待在大型队列人类研究中进一步验证。除治疗外，最近发现循环p62／SQSTM1血清水平可作为自噬标记［41］。自噬缺陷与NAFLD相关的肝癌有因果关系，可能是通过p62／SQSTM1的积累，诱导且维持致癌的NF-KB活性，并保留受损的线粒体，这些线粒体产生反应性氧化物来损伤DNA。该发现可能为NAFLD的诊断开辟了一条新的途径。

7 小结与展望

mTOR调控的信号通路与人类疾病如癌症、糖尿病、血管病变及衰老息息相关。近年来，随着AMPK／mTOR与自噬在细胞代谢及疾病发生发展中的重视作用，该通路在NAFLD的研究成为热点。因此，研究该信号通路在调节细胞生物学中的作用，对正常生理及疾病很有必要。未来的一个重大挑战是将基于细胞动物模型的研究转化为人类生理学／病理学研究，尽可能地利用靶向AMPK／mTOR与自噬的强大潜力。