S期激酶相关蛋白2对食管鳞癌细胞增殖、迁移的影响及其作用机制

高媛 ，郭敏 ，张敏 ，胡晓玲 ，翟元芳 ，师如意

1.山西医科大学医学细胞生物学与遗传学教研室，山西 太原 030001；2.山西医科大学转化医学研究中心，山西 太原 030001；3.山西医科大学药理教研室，山西 太原 030001；4.山西医科大学人体解剖教研室，山西 太原 030001

食管癌是一种消化系统的恶性肿瘤，我国食管癌的主要组织学类型为食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。ESCC死亡率居于第六位，发病率居于第七位，全球约一半的ESCC发生在中国［1-2］。食管癌早期缺乏特异性症状，且缺乏有效的治疗手段。临床数据表明，患者5年生存率为15%～20%［3］。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）是E3泛素蛋白连接酶复合物SCF（Skpl-Cullin-F-box）的底物识别组件，可识别特定的磷酸化底物并介导泛素化和随后细胞调节因子的降解［4-6］，参与调节细胞周期进程，信号转导和转录［7］。在前列腺癌［8］、黑色素瘤［9］和乳腺癌［10］等癌症中，较高水平的 Skp2与肿瘤转移和较差的生存期有关［3，7，9，11］，而Skp2的下调则导致肿瘤的生长和转移受到抑制［1］。但目前尚无Skp2基因在ESCC中的功能研究，因此阐明其功能具有重要意义。

本研究选取Skp2表达较高的ESCC细胞系KYSE150、KYSE180进行Skp2-shRNA和阴性对照（negative control，NC）慢病毒的感染，对敲低前后的细胞进行增殖、侵袭、迁移的功能试验后，采用RT-qPCR法检测Skp2潜在下游靶基因P53、P300的变化情况。

1 材料与方法

1.1 细胞及病毒 KYSE180和KYSE150细胞株由山西医科大学食管癌发病机理及转化研究重点实验室保存，均用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养；Skp2-shRNA和NC病毒由上海汉恒生物科技有限公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清、DMSO购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司；TRIzol试剂及反转录、RT-qPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；鼠抗人Skp2单克隆抗体、羊抗鼠二抗购自美国Invtriogen公司；内参GAPDH抗体购自中国proteintech 60004-1-Ig；MTT购自北京碧云天生物技术有限公司；Transwell小室及60、20 cm2培养皿购自美国Corning公司；酶标仪购自美国BioTek公司；普通PCR仪、荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；双色红外激光成像系统购自美国LICO R，odyssey公司。

1.3 稳敲Skp2基因细胞株的建立 将对数生长期的KYSE180和KYSE150细胞分别用含0.25%EDTA的胰酶消化后接种至96孔板，5×103个／孔，待细胞融合度约达50%时，按MOI=50加入Skp2-shRNA和NC病毒，吸弃原有培养基，利用半体积进行感染，4 h后补齐至正常体积；感染后24 h，吸弃含病毒的培养液，更换新鲜的完全培养基，37℃继续培养；感染后 48 h，KYSE180 细胞更换含 2 μg／mL Puromycin的新鲜培养液，KYSE150细胞更换含4 μg／mL Puromycin的新鲜培养液，筛选稳定转染细胞株，筛选完成后进行扩大培养，用于后续试验。比较细胞感染Skp2-shRNA慢病毒后，与空白细胞、NC病毒之间的功能差异及下游潜在靶基因的变化。

1.4 RT-qPCR法 使用TRIzol试剂提取KYSE180和KYSE150细胞总RNA，按说明书将2 μg总RNA加入20 μL混合体系中进行反转录，具体操作按RT-qPCR试剂盒说明书进行。PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共35个循环。RT-qPCR反应条件：95℃10 min加热激发酶活性；95℃15 s，60℃1 min，共40个循环，收集荧光数据进行分析。用于PCR扩增的寡核苷酸引物序列Skp2正义链：5′-CCATCACCCAGCTGAATCTT-3′，反义链：5′-CTGGCACGATTCCAAAAACT-3′；GAPDH 正义链：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，反义链：5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′；P53 正义链：5′-AGGTTGGCTCTGACTGTACC-3′，反义链：5′-TCTTCTTTGGCTGGGGAGAG-3′；P300 正义链：5′-TCGAGCGGAATACTACCACC-3′，反义链：5′-CGAGGCATCATCTGGTTTGG-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR结束后得到扩增曲线和Ct值，基因差异表达水平用2-ΔΔCt方法按下式计算。

ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）对照组

1.5 Western blot分析 提取KYSE150和KYSE180细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，根据上样量制备样品，经10%SDS-PAGE分离后，湿转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h；4℃孵育过夜；加入鼠抗人Skp2单克隆抗体（1∶250稀释），内参GAPDH抗体（1∶2 000稀释）；洗膜，加入羊抗鼠二抗（1∶10 000稀释），室温避光孵育2 h；洗膜，利用odyssey红外荧光扫描成像系统进行显影。

1.6 细胞增殖能力的检测 采用MTT法。将KYSE-180、KYSE150及对应的NC序列的慢病毒和敲低Skp2基因的细胞接种至96孔板中，分别在24、48、72、96、120 h 后加入 20 μL MTT，37 ℃孵育 4 h；吸弃培养基和MTT混合液，加入200 μL DMSO，于490 nm波长处检测吸光度，利用prism软件进行数据分析。

1.7 细胞迁移能力的检测 采用Transwell小室试验。用无血清培养基将空白细胞、NC细胞及稳定敲低Skp2基因的KYSE150和KYSE180细胞悬浮，接种至Transwell小室的上室，在小室下方加入含10%FBS的培养基，48 h后吸弃培养基，用棉签将多余细胞擦去，用4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色30 min，倒置显微镜下进行拍照，每个小室随机选取5个视野，统计分析数据。

1.8 细胞克隆形成能力的检测 采用克隆形成试验。将KYSE180、KYSE150及对应的NC序列的慢病毒和敲低Skp2基因的细胞接种至6孔板中，10 d后吸弃培养基，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色30 min，统计形成的有效克隆，进行比较分析。

1.9 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Skp2基因的表达情况 结果显示，感染Skp2-shRNA的细胞与空白组细胞和NC组细胞相比，Skp2基因的表达在RNA水平和蛋白水平均受到明显的抑制，见图1和图2。

图1 RT-qPCR法检测KYSE150细胞（A）和KYSE-180细胞（B）中Skp2基因的敲低效率Fig.1 Determination of Skp2 gene knockdown efficiency in KYSE150（A）and KYSE180（B）cells by RT-qPCR

图2 KYSE150细胞（A）和KYSE180细胞（B）中Skp2基因敲低效率的Western blot分析Fig.2 Determination of Skp2 gene knockdown efficiency in KYSE150（A）and KYSE180（B）cells by Western blot

2.2 下调Skp2基因对ESCC细胞增殖能力的影响结果显示，敲低Skp2基因的细胞与空白组细胞和NC组细胞相比，增殖在96 h后开始受到明显抑制，差异均有统计学意义（KYSE150细胞：F96h=3.407，P＜0.05，F120h=4.927，P ＜ 0.01；KYSE180 细胞：F96h=4.427，P ＜ 0.05，F120h=5.354，P ＜ 0.01），见图 3。

图3 Skp2基因敲低对KYSE150细胞（A）和KYSE180细胞（B）增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition of proliferation of KYSE150（A）and KYSE180（B）cells after knockdown of Skp2 gene

2.3 下调Skp2基因对ESCC细胞迁移能力的影响结果显示，敲低Skp2基因的细胞与空白组细胞和NC组细胞相比，迁移受到明显抑制，差异均有统计学意义（KYSE150 细胞：F=10.235，P ＜ 0.001；KYSE180细胞：F=9.560，P ＜ 0.001），见图 4和图 5。

图4 Skp2基因敲低后对KYSE150细胞（A）和KYSE180细胞（B）迁移的抑制作用Fig.4 Inhibition of migration of KYSE150（A）and KYSE-180（B）cells after knockdown of Skp2 gene

图5 Skp2基因敲低后对ESCC细胞迁移作用的显微镜观察（× 40）Fig.5 Microscopy of migration of ESCC cells after knockdown of Skp2 gene（× 40）

2.4 下调Skp2基因对ESCC细胞的克隆形成能力的影响 结果显示，敲低Skp2基因的细胞与空白组细胞和NC组细胞相比，克隆形成能力受到明显的抑制，差异均有统计学意义（KYSE150细胞：F=6.534，P ＜ 0.01；KYSE180 细胞：F=7.356，P ＜ 0.01），见图6和图7。

图6 Skp2基因敲低后对KYSE150细胞（A）和KYSE180细胞（B）克隆形成的抑制作用Fig.6 Inhibition of clone formation of KYSE150（A）and KYSE180（B）cells after knockdown of Skp2 gene

图7 Skp2基因敲低后对ESCC细胞克隆形成的显微镜观察Fig.7 Microscopy of clone formation of ESCC cells after knockdown of Skp2 gene

2.5 Skp2下游潜在靶基因P53和P300的表达 RT-qPCR结果显示，敲低Skp2基因的细胞与空白组细胞和NC组细胞相比，可明显增加Skp2下游靶基因P53和P300的表达。在KYSE150细胞中敲低Skp2基因后，P53、P300的表达差异有统计学意义（F分别为 4.826和4.214，P均 <0.05）；在 KYSE180细胞中敲低Skp2基因后，P53、P300的表达差异也有统计学意义（F分别为4.932和3.212，P均 <0.05）。见图8。

图8 Skp2基因敲低后其潜在下游靶基因P53和P300在KYSE150细胞（A）和KYSE180细胞（B）中的变化情况Fig.8 Changes in potential downstream target genes P53 and P300 in ESCC cells after knockdown of Skp2 gene

3 讨论

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤，病理类型分为ESCC和食管腺癌，我国主要以ESCC为主［1］。目前关于食管癌的治疗主要为手术切除原发病灶结合术后的放化疗，由于局部侵袭和远处转移的高发生率，ESCC患者的生存率仍然很低［12-15］。近年来，基因治疗在癌症临床研究中越来越普遍，基因疗法具有许多临床治疗无法比拟的优点，包括对晚期癌症转移的高选择性和有效性，以及可能实现个性化治疗，使其成为癌症治疗的一种有效手段，并可能替代手术、放射疗法和化学疗法。因此必须准确识别癌基因或抑癌基因，为患者制定更有效的治疗策略。

Skp2是F-BOX家族成员之一，参与泛素化降解、细胞周期、细胞凋亡和衰老的调控，以及Skp2-SCF复合体形式的信号转导等［10，16］，在SCF复合物中，Skp2起到底物识别因子的作用。Skp2已被证明是癌基因，与在多种肿瘤中过度表达有关，Skp2过表达可诱导前列腺增生、增生、发育不良和低分级癌［16-17］。在子宫内膜癌中，Skp2通过调控p27来调控子宫内膜癌细胞的增殖［7］。ZHANG 等［18］研究发现，Skp2在多种骨肉瘤细胞中也存在高表达的现象，在骨肉瘤小鼠模型中，使用Flavokawain A后，Skp2基因表达下降，骨肉瘤细胞侵袭及体内肺转移也会被阻断。LI等［10］研究发现，PDCD4是Skp2的重要泛素化底物，Skp2通过PDCD4降解促进乳腺癌的发生和放射耐受，放射治疗结合Skp2靶向辅助治疗可提高乳腺癌患者的临床生存率。KITAGAWA等［19］研究发现，在乳腺癌中Skp2可通过抑制P300来抑制P53依赖的凋亡。在其他癌症中也有关于Skp2促进癌细胞增殖和转移的相关报道，但Skp2基因是否在食管癌中也能起到类似的作用，且其机制如何尚未完全明确。

本研究着重探讨了Skp2基因在ESCC中的功能。在ESCC细胞系和永生化的正常食管上皮细胞系分别检测了Skp2基因的表达，结果发现，在ESCC细胞系的表达明显高于正常食管上皮细胞。然后选取KYSE150和KYSE180两个细胞株转染敲低Skp2基因的慢病毒，对相关细胞生物学行为及可能的机制进行了检测。细胞水平试验显示，在敲低Skp2基因后，细胞增殖、迁移、克隆形成能力均受到明显抑制。Skp2基因敲低后，其下游可能的潜在靶基因P53、P300的表达在RNA水平升高。本研究结果表明，在ESCC中Skp2可通过抑制P53、P300的表达促进ESCC细胞增殖、迁移。提示Skp2有可能成为ESCC一个新的治疗靶点。