脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞后外泌体的分离及鉴定

赵文苹，王建发，范春玲

黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江省牛病防制重点实验室，黑龙江 大庆 163319

乳房炎是全球公认的奶牛三大疾病之一，对奶牛养殖业造成的经济损失位居各类疾病之首，细菌感染是导致奶牛发生乳房炎的最重要因素。乳腺上皮细胞是细菌感染与乳腺免疫的初始重要交汇处，在该交汇处乳腺上皮细胞启动了机体对病原微生物最早的免疫识别和免疫应答，并发挥协调后续免疫分子、免疫细胞应答的重要作用。乳房炎的致病微生物主要有大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又称内毒素，是大肠埃希菌细胞壁的主要成分，可激活乳腺上皮细胞表面的模式识别受体，引发一系列的免疫反应。外泌体（exosome）是细胞对外分泌的小囊泡，直径为40～120 nm的膜包裹结构，可特异性包裹一些蛋白质、脂质或核酸等物质，具有生物活性，能够被受体细胞吸收，参与细胞通讯、细胞迁移、免疫应答、炎症反应、血管新生和肿瘤细胞生长等过程［1］。奶牛乳腺感染大肠埃希菌后，上皮细胞产生的外泌体可能以远距扩散的方式调节中性粒细胞等固有免疫细胞功能，进而影响乳腺炎症的发生发展过程。为明确大肠埃希菌感染对乳腺上皮细胞产生外泌体的影响，本研究对LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞后产生的外泌体进行分离鉴定，并与正常培养的乳腺上皮细胞外泌体特征进行比较。

1 材料与方法

1.1 细胞 奶牛乳腺上皮细胞系由黑龙江八一农垦大学生物技术中心牛病重点实验室提供。

1.2 主要试剂 DMEM／F12培养基购自美国Hy-Clone公司；胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液、SDSPAGE凝胶制备试剂盒及BCA试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清（FBS）购自澳洲CLARK公司；无外泌体血清购自美国SBI公司；鼠抗CD63单克隆抗体购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）及小鼠抗GAPDH单克隆抗体购自北京碧云天生物技术公司；小鼠抗HSP70及HSP90单克隆抗体购自美国普洛泰克公司。

1.3 细胞培养 取液氮罐冻存的奶牛乳腺上皮细胞系，37℃水浴快速融化，转移至离心管中，300×g离心4 min；弃上清，加入完全培养液（10%FBS+1%双抗），移入细胞培养瓶中，摇匀，于37℃恒温培养箱中培养；待细胞生长状态良好，用PBS洗涤1～2次，加入2 mL 1%胰蛋白酶，37℃消化2～3 min，加入3 mL完全培养液终止消化，转移至离心管中，300×g离心4 min；弃上清，加入完全培养液，接种至细胞培养瓶中，摇匀，于37℃恒温培养箱中培养。传代2～3次，用于后续试验。

1.4 细胞分组及处理 待乳腺上皮细胞融合度达40%～50%时，更换为无外泌体血清培养液培养，细胞融合度达70%～90%时，用终浓度为20 μg／mL的LPS与奶牛乳腺上皮细胞继续共孵育6 h；收集细胞培养液上清，即LPS刺激组。同时以未刺激的细胞培养液上清作为对照组。

1.5 外泌体的分离 收集各组细胞培养上清200 mL，分装于50 mL离心管中，于4℃，2 000×g离心10 min；去除细胞，4℃，10 000×g离心30 min；去除细胞碎片，110 000×g离心70 min；去上清，用PBS重悬，110 000 × g离心 70 min；去上清，用 100 μL PBS重悬，即获得外泌体，转移至1.5 mL的Eppendorf管中，-80℃保存。

1.6 外泌体的鉴定

1.6.1 形态学分析 将铺有碳支持膜的铜网辉光放电20 s；取各组外泌体样品20 μL，置铜网上孵育5 min；用滤纸吸干多余液体，于20 μL磷钨酸染色液中孵育15 s，室温静止10 min；待铜网干燥后，透射电子显微镜下观察，拍照。

1.6.2 蛋白浓度 采用BCA法测定各组外泌体样品的蛋白浓度，进行3次独立检测，取平均值。

1.6.3 特异性标志蛋白的表达 采用Western blot法。各组外泌体分别取30 μg样品，经15%SDSPAGE分离后，转移至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭2 h；用1×TBST缓冲液洗涤2次，每次10 min，加入小鼠抗CD63（1∶500稀释）、HSP70（1∶1 000稀释）、HSP90（1 ∶1 000稀释）及GAPDH（1∶1 000稀释）单克隆抗体，4℃过夜；用1×TBST缓冲液洗涤2次，每次10 min，加入HRP标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）（1 ∶1 000稀释），室温反应1 h；1×TBST缓冲液洗涤2次，每次10 min，ECL显影。

2 结果

2.1 细胞培养情况 奶牛乳腺上皮细胞经连续培养3代后，对照细胞贴壁生长，界限清晰，体积较大，呈典型铺路石形状；LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞6 h，细胞界限模糊，明显收缩、变圆，细胞空泡化变性、培养液中有少量漂浮的死亡细胞。见图1。

图1 乳腺上皮细胞形态学的光镜观察（×200）Fig.1 Optical microscopy of morphology of mammary epithelial cells（× 200）

2.2 外泌体的鉴定

2.2.1 形态学分析 LPS刺激组外泌体大小均一，直径均在40～120 nm之间，外形呈圆形或椭圆形的茶托样结构，可见明显膜性结构，形态无明显差异；对照组视野下外泌体密度大于LPS刺激组，但对照组含有较多杂蛋白。见图2。

图2 外泌体形态的透射电镜观察（×50 000）Fig.2 TEM of morphology of exosomes（× 50 000）

2.2.2 蛋白浓度 对照组及LPS刺激组的奶牛乳腺上皮细胞上清液中外泌体蛋白浓度均值分别为（2.59± 0.11）和（1.36± 0.14）mg／mL，前者高于后者。

2.2.3 特异性标志蛋白的表达 经LPS刺激获得的外泌体与小鼠抗CD63、HSP90和HSP70单克隆抗体可发生特异性结合，且于相对分子质量约45 000、90 000、70 000处可见相应的特异性结合条带。与对照组比较，LPS刺激组外泌体表面CD63、HSP90和HSP70蛋白表达量降低。见图3。

图3 Western blot法检测外泌体标志蛋白的表达Fig.3 Western blotting of expression of marker proteins in exosomes

3 讨论

外泌体作为生物体内一类重要囊泡，已成为当前生物医学研究热点之一。研究发现，外泌体可在动物体全身广泛传递，改变靶细胞状态［2］。奶牛乳腺组织可分泌外泌体，且乳源外泌体可在人内皮细胞内转运并被巨噬细胞摄取，进而调控其免疫功能［3-6］，涉及的免疫细胞主要包括T淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤（NK）细胞等［7］。未成熟树突细胞来源的外泌体表面的CD55和CD59可增强机体对凋亡细胞的清除作用，进而降低炎症反应［8］，表明外泌体可通过多种途径对免疫细胞的多种功能发挥重要调节作用。目前，许多研究证实，奶牛乳腺组织可分泌外泌体，且乳源外泌体可在人内皮细胞内转运并被巨噬细胞摄取，进而调控其免疫功能［7-10］。MUROVA 等［11］用地塞米松、胰岛素和催乳素处理体外培养的牛乳腺上皮细胞，发现从培养液提取的外泌体中miRNA表达模式发生了显著变化，深入研究证实，外泌体中的miR-148a可能与奶牛泌乳量相关，进而证实奶牛乳腺上皮细胞可分泌外泌体，且外泌体中包裹物质的种类受生理因素调控。金黄色葡萄球菌感染奶牛后，乳源外泌体中包裹的蛋白质、miRNA等成分也随之发生了改变［5］。

本研究连续培养奶牛乳腺上皮细胞，经LPS刺激细胞分泌获得外泌体，透射电镜结果显示，提取的外泌体颗粒直径在40～120 nm之间，均一性良好。CD63、HSP90和HSP70蛋白是外泌体的蛋白标志物，CD63是四次跨膜蛋白家族的成员，HSP90和HSP70蛋白是外泌体表面蛋白［12］，这些蛋白可特异性结合内容物并分选入外泌体。Western blot结果显示，分离物表达外泌体表面标志物CD63、HSP70和HSP90蛋白，进一步证明了电镜观察到的囊泡状物质为外泌体。本研究结果还表明，在相同培养条件下，经LPS刺激的乳腺上皮细胞分泌外泌体的蛋白浓度低于对照组，推测原因可能是由于LPS刺激导致细胞死亡较多，细胞总数减少，外泌体分泌量减少，导致外泌体蛋白浓度下降；另外，LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞使其分泌外泌体能力下降，外泌体产量减少，导致外泌体蛋白浓度下降。对上述推论今后将进一步深入研究。本研究为乳源外泌体功能的进一步研究及奶牛乳房炎疾病的防控奠定了基础。