基于前导肽和成熟区共进化提高米黑霉脂肪酶热稳定性研究

王 珏，胡丽丽，张育敏，吴 娜，李 睿

(山西中医药大学 基础医学院，晋中 030600)

天然蛋白由于性能的局限性，在一些反应中有所限制，故须对目的蛋白进行改造，以优化相关活性或稳定性。传统的方法包括理性设计点突变及定向进化技术引入随机突变[1-2]。这两种技术也并不独立，很多学者通过结合目标蛋白三级结构，对定向进化得到的随机突变位点进行分析，可筛选出对于目的基因改造更有意义的突变位点，从而打破进化瓶颈，实现改造蛋白多种性能的目标[3]。

RML是源于真菌米黑霉的脂肪酶，其全基因序列包括24个氨基酸构成的信号肽，70个氨基酸组成的前导肽以及269个氨基酸组成的成熟区3部分，其中前导肽位于成熟区的N端，主要作用是帮助目标蛋白正确折叠[4]。成熟的RML可催化甘油三酯为甘油二酯，为工业油脂的改良所应用。但由于其来源于嗜温微生物，在高压高温等环境中不稳定、易失活，不利于大规模工业生产[5]，因此，对RML热稳定性的改造显得尤为重要。近年来人们也开始通过氨基酸序列突变结合蛋白结构模拟来预测突变对于蛋白热稳定性的影响[6]，有关RML热稳定性研究的最新报道是通过计算机模拟对RML成熟区(不包括前导肽)进行定点突变及二硫键的设计，得到的突变体半衰期比野生型提高了12.5倍(70 ℃处理下)[7]。前期工作证明，前导肽突变对RML活性有影响[8]，因此，包含前导肽的全基因进化为蛋白性能的改造拓展了基因研究范围。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 RML全基因序列与pET30a构建的重组质粒，命名为pET30a-pro-RML，用作第一轮定向进化中易错PCR的模板；大肠杆菌BL21，制备感受态细胞。

1.1.2 工具酶 T4 DNA连接酶；TaqDNA聚合酶；限制性内切酶NcoI、Hind III购于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.3 试剂 细胞裂解液(用于96孔细菌培养板上裂解细胞释放酶液)；酚酞指示剂(用于酸碱滴定检测酶活指示)；Inoue转化缓冲液(用于制备超级感受态)。

1.1.4 设备与耗材 PCR仪，超声破碎仪，碱式滴定管，蛋白纯化仪，恒温(可低温)摇床，冷冻离心机，凝胶成像系统，96微孔培养板，质粒提取试剂盒，凝胶纯化试剂盒，Quick change定点突变试剂盒等。

1.2 方法

1.2.1 易错PCR与突变体文库的建立 易错PCR(体系加入Mn2+)上游引物: 5′-CGCGCCATGGTGCCAATCAAGAGACAATC-3′(包括酶切位点NcoI)；下游引物:5′-GCCGAAGCTTAAGTACAGAGGCCTGTGT-3′(包括酶切位点Hind III)。带有随机突变的RML全基因与pET30a进行连接转化，获得大量重组子。

1.2.2 RML脂肪酶突变体的诱导表达 将1.2.1转化所得突变体文库的单菌落逐一接于96孔培养板中(此板命名为母板)，于37 ℃，12～16 h培养后以2%的接种量将母板中的菌液对应转接入一块新的96孔培养板(此板命名为子板)。将转接后的菌液37 ℃进行培养诱导(IPTG终浓度为0.1 mmol/L)。诱导4 h后，离心收集子板菌体。将子板放入-80 ℃冷冻12 h以上，取出后每个培养孔中加入250 μL的细胞裂解液，放置于37 ℃ 1～2 h，使菌体裂解，目标蛋白释放在细胞裂解液中。具体方法参考文献[9]。

1.2.3 突变体热稳定性的初筛 研究采用一种新型高效的用于脂肪酶高通量筛选的方法[10],该方法选择油酸作为真实底物，通过指示剂的颜色变化，观察酶活性高低。筛选时，先将酶液置于70 ℃保温2 h，再进行活性鉴定。注意使用野生型酶液做对照。

1.2.4 突变体热稳定性的复筛 图1为野生型RML纯化前后的SDS-PAGE图，分别在37 ℃和16 ℃下诱导，可看出低温诱导蛋白表达量更高[11]，因此最终选择16 ℃为每个蛋白样品的复筛诱导条件。蛋白纯化利用Ni柱与载体pET30a的蛋白标签His-tag亲和进行纯化。以野生型蛋白为例，将1.2.3方法中通过高通量初筛得到的每个优势突变体都按照与野生型相同的诱导及纯化条件进行操作。试验采用碱滴定法测定纯蛋白的比活进行复筛。酶活定义为：酶分子每分钟催化底物(油脂)释放出1 μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位(U)，具体蛋白质比活计算公式如下：

M：蛋白标准品；1: 37 ℃诱导RML表达情况；2: 37 ℃ RML表达纯化结果；3：16 ℃诱导RML表达情况；4：16 ℃ RML 表达纯化结果

式中：V代表滴定反应体系(加酶液后)所消耗的NaOH溶液体积(mL)；V0代表滴定空白体系(无酶液)所消耗的NaOH溶液体积(mL)；t代表反应时间(min)；n代表酶液体积(纯化后)(mL)；M代表滴定用的NaOH溶液的浓度(mmol/L)(注：研究表示蛋白催化活性单位为U/mg，即需测定蛋白浓度，换算所得)。

1.2.5 定点突变和定点饱和突变 研究采用Quick-Change定点突变试剂盒，根据RML定向进化得到的随机突变位点，设计相关位点的定点突变和定点饱和突变，分别包括168位氨基酸定点突变，48位、67位、240位、311位以及313位氨基酸定点饱和突变。其中扩增目标突变体所需的上下游扩增引物见表1(其中311位和313位氨基酸相隔较近，故设计一对定点饱和突变引物)。

表1 用于定点突变和饱和突变的引物序列

2 结果与分析

2.1 RML基因突变结果

通过2轮易错PCR、2次定点突变和4次定点饱和突变，共得到9株活性和耐热性有不同程度提高的突变体，试验设计流程如图2和图3所示。

①：第一轮定向进化；②：第二轮定向进化

如图2所示，研究以野生型RML全基因为模板，进行第一轮易错PCR定向进化，得到2株热稳定性有明显提高的突变体，分别为M1：L57V/S168P和M2：D48V/V67A/T311S。将M1上的突变点S168P通过定点突变构建在突变体M2上(研究人员单独对57位和168位突变点进行单点突变，发现L57V的单点突变体经过热处理后，几乎不表现活性，故选择放弃该突变点)，得到突变体M3：D48V/V67A/S168P/T311S；然后以M3的重组基因为模板，进行第二轮易错PCR定向进化，得到突变体M4：D48V/V67A/S168P/F240S/T311S和M5：D48V/V67A/S168P/T311S/D313H，都表现出更高的热稳定性；之后将M4上的突变点F240S和M5出现的突变点D313H通过定点突变结合，得到突变体M6：D48V/V67A/S168P/F240S/T311S/D313H。

由图3所示，从突变体M6出发，选择两轮定向进化出现的突变点进行定点饱和突变，包括两个位于前导肽的突变点(48位和67位)，以及3个位于RML成熟区的突变点(240位、311位及313位)，分别得到突变体M7：D48V/A67D/S168P/F240ST311S/D313H，M8：D48V/V67A/S168P/S240A/T311S/D313H，M9：D48V/V67A/S168P/S240A/S311C/D313H，相对M6而言，都表现为更高的热稳定性，其中以M9最佳(168位氨基酸出现脯氨酸置换，根据脯氨酸的热稳定性效应[12],故不再对该位点进行饱和突变)。

图3 从M6菌株出发，进行4轮定点饱和突变流程示意图

2.2 RML突变体热稳定性检测结果

将野生型RML以及蛋白突变体M1-M9放置70 ℃ 2 h进行热处理，检测其保留活性，同时以常温(37 ℃)酶活做对比。检测结果如图4所示。研究证明，通过2轮定向进化、2次定点突变和4轮定点饱和突变，成功提高了RML的热稳定性，从野生型RML到突变体M9，无论是37 ℃时的酶活，还是70 ℃热处理后的酶活，整体都呈现出增长的趋势。野生型RML经热处理后几乎不表现活性，而M9经热处理后，保留活性可达(1 316±31)U/mg(保留38%)。同时，RML在37 ℃下对甘油三酯的催化活力从(253±20)U/mg提高到(3 609±100)U/mg，提高了14.3倍。另一方面，M7与M4和M5相比，M7在37 ℃下的蛋白比活较前两者高，但其热处理后的稳定性有所降低，这个现象可由Dan S.Tawfik[13]提出的“折衷(trade off)”理论来解释，并不是所有突变体在常温下的活性和热处理后的活性都是相对应提高的，该学者指出很多时候定向进化中的突变是不稳定的(Destabilizing mutations，△△G>0)，即某些突变点提高蛋白质在常温下的比活是以降低其稳定性为代价。因此，寻找一个常温和热处理后活性都能明显提高的突变体(M9)就尤为重要。

图4 RML野生型和9株突变体的比活及热稳定性变化趋势

3 讨论

3.1 突变位点氨基酸性质分析

如表2所示，突变体M1-M9的获得过程中，共出现10次不同位点的突变，其中有6次突变都是趋向于向疏水性氨基酸的改变。氨基酸侧链从极性变成非极性后与有利于为底物与酶的结合提供疏水环境，降低结合状态的自由能，从而有利于催化反应的进行。又发现M7比M6热稳定性降低是由于67位氨基酸由疏水性丙氨酸突变为酸性的天冬氨酸，这一系列试验数据说明定向进化过程中疏水性氨基酸的出现可能对目的蛋白形成更稳定的“内核”结构有帮助，从而稳定蛋白的整体结构；另一方面，酶分子的疏水性内核常常都作为其活性中心域，这也为疏水性氨基酸的出现可提高目的蛋白热保留活性作出解释。

表2 突变体 M1-M9突变位点氨基酸性质分析

3.2 突变位点氨基酸空间结构分析

图5(a)是野生型RML的三级结构示意图(PDB：6QPP)，其中，A点与B点之间为RML前导肽，B点和C点之间为连接区，C点和D点之间为RML成熟区的蛋白结构；图5(b)是突变体M9的蛋白三级结构预测图(http://swissmodel.expasy.org/)，根据基因研究范围，该结构含有前导肽和蛋白成熟区。

数据来源：NCBI，蛋白序列号6QPP

突变体M9与野生型蛋白的结构同源性较高，因此M9仍具备野生型RML的相关性能，且可用作氨基酸突变位点的分析。M9的热稳定性得到了明显提高，其基因包含6个突变位点：D48V、V67A、S168P、S240A、S311C以及D313H。使用Chimera软件，对以上突变位点进行分析，结果见图6。

图6(a)显示48位氨基酸上游是前导肽的α螺旋，48位原Asp被疏水性Val替代，可能有利于区域结构的稳定，而疏水作用的增强，有利于α螺旋的稳定[14]，因此该位点的突变可能帮助稳定了前导肽的α螺旋。图6(b)显示67位氨基酸位于前导肽和成熟区的连接处，其下游是成熟区蛋白的第一个β折叠，该位点由Val突变为Ala，氨基酸侧链基团更小，可能使得前导肽和成熟区相连接区域的空间位阻更小，而前导肽的主要功能是帮助与其相连的目标蛋白正确折叠表达，因此，以上两个位点的突变可能都通过对前导肽区域的优化而有利于RML热稳定性的提高。图6(c)显

图6 M9突变位点分析

4 结论

研究以包含前导肽的RML全基因为研究对象，利用易错PCR定向进化技术，定点突变，定点饱和突变相结合策略，成功提高了RML的热稳定性，同时，由于RML可以水解甘油三酯为甘油二酯，从而改良油脂的营养和性能，因此这一研究结果对工业生产也具有重要意义。另一方面，通过基因改造的过程发现，往往需要多种方法结合才能更好地设计一条“流畅的通路”以提高目的蛋白的相关性质，而对于RML前导肽和成熟区共同进化的事实也为蛋白定向进化提供了新的思路和方法。