CNR1基因rs1049353位点多态性与早期2型糖尿病患者利拉鲁肽疗效的关系

杨晓旭，赵振宇

天津医科大学朱宪彝纪念医院，天津300400

有研究发现，2 型糖尿病对神经性疾病、心血管疾病、视力障碍、脑卒中、肾病等代谢并发症的潜在影响较大［1-3］。利拉鲁肽作为临床常用的肠促胰岛素激素，与人体内源性酰化胰高血糖素样肽1（GLP-1）氨基酸序列高度相似，具有天然GLP-1 的功效和代谢稳定性，可有效降低患者的血糖水平，单独应用或与其他药物联合应用，降血糖效果均较好［4］。但因个体基因有差异，2 型糖尿病的疾病进展也不相同，对同种治疗药物的反应也有差异［5］。有学者分析了全基因、候选基因组发现对2 型糖尿病提供贡献作用的遗传变异相关位点有近100 个［6］。内源性大麻素受体1 型（CNR1）基因位于人类染色体6Q14～Q15，全基因共有外显子8 个，在不同群体中表达均有差异，可影响大麻素类物质功能及其代谢［7］。有研究发现，CNR1 基因 rs1049353 位点的单核苷酸多态性与2 型糖尿病药物疗效有关［8］。现阶段，对于CNR1 基因rs1049353 位点多态性与利拉鲁肽治疗早期2 型糖尿病疗效的关系研究较少，故本研究对此进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择本院2018 年2 月—2020 年2月收治的早期2 型糖尿病患者241 例，男133 例、女108 例，年龄（46.54 ± 8.03）岁，病程（1.21 ± 0.24）年。纳入标准：①符合《中国2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》［9］中相关诊断标准；②BMI 为 23.0～32.0 kg/m2；③病程≤2 年，接受利拉鲁肽治疗，且二甲双胍单用或使用其他药物口服或皮下注射治疗血糖控制较差；④餐后2 h 血糖（2 h PG）≥11.1 mmol/L或空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L，糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5%［9］。排除标准：①经临床诊断为其他类型糖尿病、肝肾疾病；②既往接受GLP-1类药物治疗；③存在脑卒中、心肌梗死等心脑血管疾病；④治疗时还采用其他降血糖类药物治疗；⑤伴恶性肿瘤。患者均签署知情同意书。本研究已获得本院医学伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 患者均给予利拉鲁肽［诺和诺德制药有限公司（中国），规格∶3 mL∶18 mg］皮下注射，以0.6 mg/d 为初始剂量，随后剂量逐渐加至1.2 mg/d，可根据患者的耐受情况、血糖水平调整，但最大剂量<1.8 mg/d。连续治疗4个月。

1.3 BMI计算及2 h PG、HbA1c、FPG检测 测量患者体质量及身高，计算BMI，BMI=体质量/身高2。于治疗前后抽取患者静脉血2 mL，用低压液相色谱法测定HbA1c，用己糖激酶法测定FPG、2 h PG。

1.4 CNR1 基因多态性检测 于治疗前抽取患者外周静脉血5 mL，从全血中提取基因组DNA，采用Chelex-100 法从全血中提取基因组DNA，将所提取的DNA 置于冰箱（-20 ℃）中保存，并用聚合酶链反应（PCR）扩增，设计上下游PCR 引物，位点为1260G>A，即rs1049353，扩增该位点及附近的DNA 片段，扩增条件：95 ℃初始变性6 min，94 ℃变性30 s 共35个循环，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸7 min。 1260G>A 位点上游引物序列5'-GAAAGCTGCATCAAGAGCCC-3'，下游引物序列5'-TTTTCCTGTGCTGCCAGGG-3'。在37 ℃用MSPⅠ限制性核酸内切酶5U（德国圣莱昂罗特酵素股份有限公司）过度消化PCR 产物10 μL，用2%琼脂糖凝胶电泳分离消化，将A等位基因切割，片段92、19 bp；G等位基因未切割，片段111 bp。

1.5 外周血单核细胞（PBMC）内CNR1 mRNA 表达检测 治疗前收集患者新鲜外周血标本164 例。对所得样本用淋巴细胞分离液Histopaque-1077 提取PBMC，采用 TRIzol 试剂提取 PBMC 中的 RNA，用美国RT-PCR 仪进行检测。扩增条件：95 ℃初始变性10 min，95 ℃变性30 s，共35 个循环，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸7 min。CNR1-1260G>A 上游引物序列 5'-TTCACAGGGCCGCAGAAAG-3'，下游引物序列5'-GAGGCATCAGGCTCACAGAG-3'。探针序列：突变型5'-VIC-ATCAAGAGCACAGTCAA⁃GATTGCC-TAMRA-3'，野生型 5'-Fam-ATCAAGAG⁃CACGGTCAAGATTGCC-TAMRA-3'。用 2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS24.0 统计软件。计量资料用±s表示，比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CNR1 基因 rs1049353 位点的分型 241 例患者 rs1049353 位点的分型：GA 型 46 例，占 19.09%；AA 型 5 例，占 2.07%；GG 型 190 例，占 78.84%。等位基因频率最小为0.107，均符合哈迪温伯格平衡（P>0.05）。因 AA 型例数少，将 AA 型与 GA 型患者合并用于后期分析。GA 型/AA 型患者男33 例、女18 例，年龄（46.71 ± 8.94）岁；GG 型患者男 100 例、女90 例，年龄（46.50 ± 7.83）岁。两种类型患者性别、年龄比较差异无统计学意义（P均>0.05）。

2.2 241 例患者治疗前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比较 241 例患者治疗后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG均较治疗前降低（P<0.05），见表1。

2.3 不同基因型患者治疗前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG 比较 治疗前不同基因型患者BMI、2 h PG、HbA1c、FPG 比较差异无统计学意义（P均>0.05）；治疗后 GA 型/AA 型、GG 型 BMI、2 h PG、HbA1c、FPG 水平均较治疗前降低（P均<0.05），GA型/AA 型患者 BMI、HbA1c、FPG 均较 GG 型患者低（P均<0.05），不同基因型患者2 h PG 水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表1 241例患者治疗前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比较（±s）

表1 241例患者治疗前后BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比较（±s）

时间治疗前治疗后t P BMI（kg/m2）25.91±1.64 22.67±1.58 22.087 0.000 2 h PG（mmol/L）14.93±1.82 8.71±1.56 40.282 0.000 FPG（mmol/L）11.69±1.66 6.36±1.55 36.433 0.000 HbA1c（%）9.54±0.96 6.86±0.82 33.003 0.000

表2 不同基因型患者BMI、2 h PG、HbA1c、FPG比较（-x± s）

2.4 不同基因型患者CNR1 mRNA 表达比较 164例患者提取 PBMC 合格样本，其中 AA 型 1 例、GA 型30 例、GG 型133 例，且基因型分布频率与哈迪温伯格平衡相符（P>0.05）。GA 型/AA 型、GG 型患者PBMC 中CNR1mRNA 的相对表达量分别为2.13 ±0.87、4.98 ± 1.65，GG 型患者PBMC 中CNR1 mRNA的相对表达量高于GA 型/AA 型患者（t=7.711，P<0.05）。

2.5 不同基因型患者利拉鲁肽不良反应比较 不同基因型患者不良反应发生率比较差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 不同基因型患者利拉鲁肽不良反应比较［例（%）］

3 讨论

2 型糖尿病是常见的内分泌代谢疾病，具有较高的发病率［10］。临床上常通过控制血糖指标的方式对其进行治疗，从而改善胰岛β细胞功能，刺激第一时相胰岛素的分泌，以解除糖毒性的不良影响。利拉鲁肽是GLP-1受体激动剂，可促进胰岛素分泌，并抑制胰高血糖素分泌，阻止胰岛β细胞的凋亡，有效控制血糖［11］。基因多态性对药物疗效有一定影响。CNR1 基因是介导大麻素发挥作用的重要分子，可参与机体多种生理和病理过程。有研究发现，当小鼠CNR1 基因被敲除后，会降低血中瘦素、胰岛素的水平，从而影响机体消耗血糖水平与能量；在CNR1基因的3'侧翼区存在的AAT重复序列，可于DNA 内部形成Z 型结构，影响其转录功能及大麻素的正常功能［12］。CNR1 系统失调与多种代谢性疾病紧密联系，其多态性位点rs1049353 参与着多种病理学疾病，如克罗恩病、冠状动脉疾病等［13］。CNR1 是 2 型糖尿病的重要关联易感基因，研究CNR1 多态性并分析其对利拉鲁肽治疗早期2 型糖尿病疗效的影响，探讨其作用机制，具有重要临床意义。

本研究结果显示，GG 型在2 型糖尿病患者中占较高比例。赵倩等［14］研究表明，在纳入的230 例早期 2 型糖尿病患者中，GG 型 188 例，占比为 81.7%，略高于本研究。分析其原因可能为所选取研究对象的地区差异、年龄差异等因素造成。本研究患者采用利拉鲁肽治疗后，BMI、2 h PG、FPG、HbA1c 均低于治疗前，说明利拉鲁肽可较好地控制机体血糖、BMI。分析其原因为利拉鲁肽作为GLP-1 受体激动剂，可延缓胃排空，抑制食欲，在一定程度上降低了机体BMI，从而减轻肥胖。有研究表明，2 型糖尿病患者高血糖的出现是与胰岛素分泌受损、胰岛β 细胞功能障碍有关［15］。利拉鲁肽以依赖葡萄糖浓度的方式，增强胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，还可最大程度解除糖毒性的影响，改善胰岛素抵抗，延缓胰岛β 细胞衰竭，从而降低患者血糖［16］。另有研究表明，利拉鲁肽还可作用于磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2/c-jun氨基末端激酶1/2 信号通路，抑制β 细胞凋亡，改善血糖［17］。另治疗后 GA 型/AA 型、GG 型BMI、2 h PG、HbA1c、FPG水平均较治疗前降低，治疗后GA型/AA型 BMI、HbA1c、FPG 水平均较 GG 型低，而不同基因型患者2 h PG水平比较差异无统计学意义。这可能是CNR1基因中的1260G>A 位点可影响中枢和外周神经系统，从而直接或间接影响利拉鲁肽治疗早期2 型糖尿病的效果。因此临床可根据患者基因型合理选择治疗药物。

另本研究结果显示，GG 型CNR1 mRNA 的相对表达量高于GA 型/AA 型。与野生型GG 型患者血糖、BMI 水平比较，GA 型/AA 型患者血糖、BMI 控制更佳，临床疗效更好。分析其原因为CNR1 为内源性大麻素系统中的重要基因，可作用于外周、中枢系统，并调控腹侧纹状体、丘脑、海马及边缘系统的杏仁核，影响神经系统，进而影响食欲。GG 型为野生型，属于显性基因，相对于GA 型/AA 型这一突变型基因而言，于人体中存在的比例较高。CNR1 G等位基因高表达，会增加患者食欲，表现出糖尿病的多饮、多食等典型症状，因此GG 型CNR1mRNA 的相对表达量较高，影响疗效。而A 等位基因携带者经药物治疗后，胰岛素抵抗明显减轻，并可提高代谢值，体质量减轻，从而对利拉鲁肽治疗早期2型糖尿病效果产生影响［18］。

本研究中不同基因型患者不良反应发生率比较无差异，说明不良反应不会受基因分型的影响，各型患者使用利拉鲁肽均较为安全。目前，CNR1 基因多态性对早期2 型糖尿病的作用靶点、发病机制尚未完全明确，后期仍需深入探讨其作用机制。同时本研究也存在不足之处，如研究对象为单中心，群体代表性上存在一定局限性，对于环境背景、遗传不同的人群研究不适用，后期将纳入多中心、多种人群以做进一步深入研究。