水貂亲缘关系鉴定及繁殖性状分子标记研究进展

宋姗姗，宋兴超，张如，杨童奥，刘琳玲，丛波，林鹏

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林省特种经济动物分子生物学省部共建国家重点实验室，农业部特种经济动物遗传育种与繁殖重点实验室，吉林长春130112；2.铜仁学院，贵州铜仁554300；3.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州121013）

分子标记以特异性DNA片段的核苷酸变异为基础，能够直接反映出DNA水平的遗传多态性、生物个体或种群间基因组中差异的一种遗传标记技术。其优点为范围广、遗传稳定和直观准确，是动物领域遗传育种方向的一项新兴应用技术。分子标记在多个领域中都有应用，其中在标记辅助选择（Marker assisted selection，MAS）上的应用推动了育种工作的发展[1]。早期水貂的品种鉴定方法是通过水貂的品种形态学标记和生产性能测定，现今已发展到在分子水平上对水貂进行品种资源的多样性分析和相关重要经济性状的测定。分子标记在水貂品种育种方面和遗传评价的广泛应用，对我国水貂种貂繁殖、良种化及核心群体的建立具有十分重要的意义[2]。

2007年首次构建水貂简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）遗传图谱，该图谱的建立推动水貂的分子遗传标记的发展，SSR分子标记因其多态性高、信息量大、PCR检测方便及分布在全基因组中而被广泛应用于许多遗传研究中，成为最受欢迎的分子标记之一，然而，由于缺乏有关参考基因组侧翼标记序列的信息，这些标记的可用性受到阻碍[3]。Cai Z等[4]首次公布了水貂全基因组信息，这使得应用序列基因分型（Genotyping-by-Sequencing，GBS）鉴定整个水貂基因组中的SNP成为可能。下一代测序（Next-generation sequencing，NGS）技术应运而生，其优点是能降低成本并且能高通量的进行基因分型。限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease，RE）可以降低基因组的复杂性，通过使用NGS生成序列标签，我们选择对甲基化敏感的RE可以避免基因组的重复区域，从而降低基因组的复杂性。GBS获得全基因组遗传标记已成为动物的遗传学研究和育种的热点[5，6]。科学家们在许多非模式动物中采用了相同的策略发现分子标记来进行种群、遗传学和基因组学研究。

1 分子标记在水貂品种亲缘关系中的研究进展

DNA序列的差异可以判断物种亲缘关系的远近程度，即DNA序列的相似度越高，其亲缘关系越近。研究发现在基因水平上的第一代个体具有特别微小的差异，在分化的过程中，其变异数量越来越多。由此研究人员可应用DNA标记分析和检测动物品系间亲缘关系和遗传多样性[7]。

微卫星，简单序列重复（SSRs）或短串联重复（Short tandem repeats，STRs）序列，是基因组中由短DNA基因序列（通常2～6个核苷酸长）连续重复多次（如GTGTGTGTGT）组成的区域[8]。在真核生物基因组中，均匀分布大量简单重复序列，每个重复片段仅有各2～6个核心碱基组成，这些串联或简单重复序列被称为微卫星，通过计算微卫星标记位点在群体中的等位基因频率，进行亲缘关系的确定[9]。王雷等[10]利用微卫星标记对单个水貂群体进行多态性测定和统计学分析，研究发现银蓝水貂和珍珠水貂聚为一类，丹麦红眼白水貂和丹麦标准水貂聚为一类，该结果符合实际，说明利用微卫星标记技术可识别和研究水貂品种、类群间的亲缘关系。

1994年简单序列重复区间（Inter-simple sequence repeat，ISSR）标记首次被提出，是一种新型的简单重复序列DNA扩增多态性检测技术[11]。ISSR是一个利用真核生物中丰富的SSR基序的多位点显性标记[12]。ISSR使用与SSR序列互补的引物（14～17个）碱基对（bp）[8]，这些引物在3′或5′末端有或没有短的（1～3 bp）寡核苷酸锚点，从而中断重复序列，如（CACACACACAGT）。锚点可以确保引物靶向SSR的任何一个末端。5'锚定引物扩增的产物包括目标SSR序列本身及其之间的DNA区域，而3'锚定引物扩增的产物主要包括目标SSR之间的区域。PCR在一个反应中产生多个长度可变的DNA片段（每个片段被认为是一个位点），进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分型。这些片段的数量和大小可作为遗传变异研究的基础[13]。2010年，杨洪雁等[14]采用ISSR标记技术分析水貂遗传多样性，进行聚类分析发现5个水貂群体被分为两类：短毛黑、咖啡、蓝宝石和红眼白水貂聚到一类，而仅有金州黑貂聚为一类，表明金州黑貂和其他4种貂的亲缘关系较远，其中咖啡色貂和蓝宝石貂是首先聚在一起的两种品种，表明它们亲缘关系很近。因此，我们可利用分子育种技术研究水貂种群的亲缘关系。

随机扩增微卫星多态性（Random amplified microsatellite polymorphism，RAMP）是利用随机引物和微卫星的上游或下游引物一起作为该扩增的引物，进行PCR扩增，该方法更适合于研究遗传背景尚不太清晰的物种遗传多样性[15]。PCR分子标记已广泛应用于动物品种鉴定，系统发育分析和种群研究。王红梅等[16]通过分析遗传距离和基因分化系数发现，水貂与彩貂的品种间遗传分化程度较低，因此该遗传变异是群内变异。

2 分子标记在水貂繁殖相关性状基因中的研究进展

产仔数、成活率和初生窝重等是衡量水貂繁殖性状的指标。水貂通常在温、湿度和食物等较适宜的季节出生，通过延迟胚胎着床，使幼仔的初生时间延后，从而保证存活率[17-22]。曹新燕等[23]发现由于水貂繁殖性状的变异系数较大，即遗传选择力较大，可以通过选育来提高水貂的繁殖性能。研究表明水貂存在专性滞育现象，导致水貂妊娠期变异系数较大。

NCOA1是配体依赖性转录因子家族的成员之一[24]，与DNA上的核受体结合增强转录活性，从而调控动物的生长发育、繁殖等一系列生理过程[25]。NCOA1是生殖激素的“开关”，影响胎盘的形态和胚胎的存活率[26]。霍自双等[27]采用RFLP-SSCP技术研究水貂NCOA1基因，筛查SNPs并分析其与繁殖性状的关联性，发现g.151536T＞C位点与水貂的产仔数和活仔数性状具有极显著差异（P＜0.01)，其中AB型个体的产仔数和活仔数高于AA型个体。g.185142C＞A位点对繁殖性状无影响（P＞0.05)。我们推断，NCOA1基因可作为水貂繁殖性状的候选基因，从而为水貂育种提供理论依据。

FSH是一种糖蛋白激素，在下丘脑-垂体-卵巢轴上，它通过血液循环系统，使下丘脑分泌抑制因子作用于脑垂体，最后运输到卵巢，与相应的特异性受体结合发挥生物学作用[28，29]。研究表明，FSH基因可以调控性腺功能和卵巢发育[30]，还可以通过刺激动物卵泡的生长来促进动物的性成熟[31]。Van等应用FSH刺激休情期母貂后，可加快卵泡的生长速度，使停滞生长的卵泡进入减数分裂阶段[32]。王红梅等[33]在外显子3处发现了一个SNPs，该突变位点与产仔性状无显著差异。霍自双等[27]采用PCR-SSCP技术检测了红眼白水貂FSH基因与繁殖性能的关系，研究发现FSH基因的g.1228G＞A位点对红眼白水貂的产仔数有显著影响（P＜0.01），分析该位点3个基因型发现AA和AB型个体活仔数和产仔数明显高于BB型个体，并且在繁殖性能上呈现BB＜AB＜AA的递增趋势。g.1866T＞C位点对产仔数有显著影响（P＜0.05）。DD型个体产仔数高于CD型个体。我们可以推断，FSH可以刺激水貂的发情和加快卵泡的生长，从而调控动物的繁殖性能。分子遗传标记技术在水貂繁殖性状相关的两个基因上的应用，筛查到的突变位点可作为水貂繁殖性状的遗传标记位点，为水貂的遗传育种奠定理论基础。

3 展望

常规育种方法存在不足，如需要长期进行品种登记和种公貂利用年限短且还没达到生产年限就会被淘汰。然而分子育种具有明显的优越性，能有效提高研究目的性和研究效率。分子育种的优越性是在DNA水平上，可达到早期选种和选育的目的，可准确地选育低遗传力性状、限性性状和难以测量的性状的品种。

分子遗传标记技术是动物品种或基因型鉴定一种新的有力工具。一个物种的标记系统并不一定说明它对另一个物种的适用性，标记的选择通常取决于标记系统使用的目的。分子遗传标记技术是一种简单、经济、快速、廉价和有效的研究动物遗传多样性的系统。通过分子遗传标记来鉴定亲缘关系，为品种鉴定提供了一种可靠的方法，有助于育种者寻找新的变异来源和探索控制遗传数量性状的遗传因素。

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