广叶绣球菌水溶性多糖结构表征及其对巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响

谢 添，郝正祺，常明昌,，孟俊龙,，刘靖宇,，冯翠萍

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801；2.山西省食用菌工程技术研究中心，山西太谷 030801）

广叶绣球菌（Sparassis latifolia）是一种极珍贵的药食两用菌，含有丰富的营养物质[1-2]，其中，多糖是主要的生物活性成分，含量可达干质量的39.3%～43.6%。多糖组成中以β-葡聚糖含量最高，其具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[3-5]。有研究表明，广叶绣球菌多糖可以刺激细胞因子的产生和分泌，提高小鼠的先天免疫能力，发挥抗肿瘤活性[6-7]。另有研究表明，广叶绣球菌多糖具有一定亚硝酸盐清除能力以及抑菌、免疫和抗氧化的能力[8-9]。

对多糖结构的表征是认识其生物活性的基础。王萌皓等[10]研究表明，广叶绣球菌多糖分子质量范围为215 u～393 ku，由摩尔比为13∶4∶1∶2∶3的葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖组成，具有一定清除自由基和促进巨噬细胞增殖的能力。广叶绣球菌酸性多糖分子质量为5.8 ku，由摩尔比为2∶7∶1∶2的半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖组成，具有一定的抗氧化能力[11]。关于广叶绣球菌水溶性多糖的结构表征与其功能研究还鲜见报道。

本研究采用超声波辅助水提醇沉法，并经分离纯化后从广叶绣球菌子实体中得到广叶绣球菌水溶性多糖组分，对广叶绣球菌水溶性多糖的分子质量、单糖组成、表观及分子形貌等进行结构表征，同时研究其对巨噬细胞RAW264.7 增殖活力的影响，旨在为今后广叶绣球菌水溶性多糖的开发利用提供一定结构信息和科学基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验对象 广叶绣球菌子实体，由山西省清徐县太和食用菌栽培基地提供。

1.1.2 主要试剂 核糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖等标准品均购自美国Sigma公司；大孔树脂HZ-830、阴离子交换柱（DEAE-52）纤维素粉末、交联葡聚糖凝胶柱（Sephadex-G100）粉末、T-右旋糖酐标品（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000）均购自北京索莱宝科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器设备 超声波细胞破碎仪（Scientz-1200E）、恒流泵（DHL-ZB）、电脑全自动部分收集器（DBS-100A）、冷冻干燥机（PL-3000）、凝胶色谱柱（TSK-GEL-4000PWXL）、傅里叶变换红外光谱仪（Tensor27）、紫外分光光度计（Cary 4000）、凝胶渗透色谱（1200）、离子色谱仪（ICS-3000）、原子力显微镜（SPA-300 HV）、扫描电镜（JSM-6010）、激光粒度分析仪器（WJL-628）。

1.2 试验方法

1.2.1 广叶绣球菌水溶性多糖的分离纯化 参照文献[9]多糖制备方法，得到广叶绣球菌水溶性多糖，命名为SLP-a 和SLP-b。

1.2.2 广叶绣球菌水溶性多糖分子量测定 其参照文献[12]进行。采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定SLP-a 和SLP-b 的分子质量。具体色谱条件为：色谱柱；检测器示差折光检测器；柱温为40 ℃；上样量为20 μL；上样质量浓度为2 mg/mL；流动相为蒸馏水；流速为0.6 mL/min。

1.2.3 广叶绣球菌水溶性多糖单糖组成测定 其参照文献[13]使用离子色谱仪进行色谱分析。采用色谱柱Carbopac PA20 柱（2 mm×250 mm）进行梯度洗脱：100%200 mmol/LNaOH 0～2 min，10%200 mmol/L NaOH 和90%超纯水2.1～20.0 min，100%200 mmol/L NaOH 20.1～40.0 min；采用阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、葡萄糖等作为单糖的标准品。

1.2.4 广叶绣球菌水溶性多糖特征吸收峰的检测 其参照文献[14]进行。分别称取2 mg 的SLP-a和SLP-b，以红外光谱仪在400～4 000 cm 范围内进行检测。

1.2.5 广叶绣球菌水溶性多糖表观形貌观察 其参照文献[15]进行。将2 种冻干后的水溶性多糖SLP-a和SLP-b 粉末，黏于铜质样品台，对样品表面进行喷金，采用扫描电镜（SEM）观察其表面的结构。

1.2.6 广叶绣球菌水溶性多糖分子形貌观察 参照文献[15]制备质量浓度为10 μg/mL 的SLP-a 和SLP-b 多糖溶液，过0.45 μm一次性滤器后，取10 μL多糖稀释液滴在新鲜剥离的云母片表面上，室温下干燥过夜。采用原子力显微镜（AFM）观测多糖形貌。

1.2.7 广叶绣球菌水溶性多糖对巨噬细胞RAW264.7 增殖能力的影响 参照文献[16]采用噻唑蓝法（MTT）检测巨噬细胞RAW264.7 增殖能力。取对数生长期巨噬细胞RAW264.7，培养至贴壁生长后吸去培养基，以不加入多糖的培养基细胞作为空白对照，其余组中分别加入含有1.95、3.9、7.812 5、15.625、31.25、62、125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL 的SLP-a 和SLP-b 的细胞培养基，继续培养24 h 后吸去培养基，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行清洗，每孔加入20 μL MTT 工作液，继续培养4 h；弃去上清，每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO）溶液，振摇15 min，490 nm 下使用酶标仪测定OD 值，以仅含多糖的孔为背景误差组。

1.3 数据处理与分析

采用Graphpad Prism 5.0 软件进行数据分析，采用t 检验对同一浓度下不同处理组与对照组的显著性进行分析（P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著），所有试验均重复3 次，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 广叶绣球菌水溶性多糖的分离纯化

如图1 所示，将粗广叶绣球菌多糖（SLPs）经DEAE-52 分离得到的水相组分进一步通过Sephadex-G100 柱分子筛作用后，得到2 个吸收峰，分别收集后，经浓缩、冻干得到2 个组分的广叶绣球菌水溶性多糖命名为SLP-a 和SLP-b。

2.2 广叶绣球菌水溶性多糖分子质量的测定

由图2 可知，SLP-a 和SLP-b 的分子质量分别分布于6 346 u～125 ku 和217 u～196 ku 的范围。

2.3 广叶绣球菌水溶性多糖单糖组成分析

由图3 可知，SLP-a 由摩尔比为64∶1∶19 的果糖、木糖、甘露糖组成；SLP-b 由摩尔比为12∶1∶6∶3 的葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖组成。

2.4 广叶绣球菌水溶性多糖特征吸收峰分析

由图4 可知，SLP-a 和SLP-b 均具有典型的多糖吸收峰，2 种多糖样品分别在波数为3 417.75 cm-1和3 385.95 cm-1处出现一宽而钝的强吸收峰，主要是多糖分子间游离羟基和氨基官能团的特征吸收峰，由O-H 和N-H 分别伸缩振动引起；分别在波数为2 927.12 cm-1和2 931.57 cm-1处出现中强的尖峰，是由亚甲基-CH2-中的C-H 伸缩振动引起；分别在波数为1 641.80 cm-1和1 641.25 cm-1处出现强吸收峰，主要是由官能团-COOH 或-CO-中的C＝O 非对称伸缩振动引起；分别在波数为1 111.95 cm-1和1 100.72 cm-1处出现强吸收峰，主要是吡喃糖环的C-O-C 和C-O 单键的吸收峰。

2.5 广叶绣球菌水溶性多糖表观形貌观察

由图5 可知，SLP-a 和SLP-b 为簇状堆积交织结构；在放大300 倍下进行观察发现，SLP-b 较SLP-a 可呈现一定更为紧密、集中的网状结构。

2.6 广叶绣球菌水溶性多糖分子形貌观察

如图6 所示，在原子力显微镜5 μm 下观测发现，SLP-a 分子呈现为少分支及单链状构象；SLP-b分子呈现为球形及大小不一短链构象，在800 nm下进一步观测发现，SLP-a 多糖单链的链宽和链高分别为17.42～35.41 nm 和0.34～0.96 nm；SLP-b多糖单链的链宽和链高分别为27.07～32.56 nm 和0.52～1.36 nm，其中，球形的直径和高度分别为26.31～60.51 nm 和0.93～3.58 nm。

2.7 广叶绣球菌水溶性多糖对巨噬细胞RAW264.7 增殖活力的影响

由图7 可知，当多糖质量浓度在0～250 μg/mL范围内，SLP-a 和SLP-b 能够促进RAW264.7 巨噬细胞的增殖；当SLP-a 质量浓度在31.25 μg/mL 时，促进细胞增殖能力最强，且与对照组相比差异达极显著水平（P ＜0.01）；当SLP-b 质量浓度在15.625 μg/mL 时，与对照组相比差异达极显著水平（P＜0.01），此时促进细胞增殖能力最强。

3 结论与讨论

本试验针对广叶绣球菌水溶性多糖进行了分离纯化，得到了SLP-a 和SLP-b 这2 种组分，并对其结构进行了相应的表征，结果表明，SLP-a 和SLP-b 分子质量分别为6 346 u～125 ku 和217 u～196 ku；SLP-a 由摩尔比为64∶1∶19 的果糖、木糖、甘露糖组成，SLP-b 由摩尔比为12∶1∶6∶3的葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖组成。SLP-a 分子呈现为少分支及单链状构象，SLP-b 分子呈现为球形及大小不一短链构象；SLP-a 和SLP-b 表观均为簇状堆积，交织，结构规律性不强，具有一定粗糙、紧密、集中的网状结构。

食用菌多糖发挥生物活性与其结构有关，因此，本试验在探讨多糖结构的基础上，进一步分析了SLP-a 和SLP-b 促进巨噬细胞增殖的能力，结果表明，多糖的分子质量范围、单糖组成、构象和官能团类型等方面与其生物活性密切相关[17]。通常当分子质量在100 u～200 ku 的范围时，多糖具有良好的生物活性[18-21]。另有研究表明，处于活性分子质量范围内的多糖分子，其水溶性较高，在水中的黏度较低，因而，其基团的活性较高，能提高多糖的生物活性[22]。本研究结果表明，SLP-a 的分子质量范围为6 346 u～125 ku，SLP-b 的分子质量范围为217 u～196 ku，由于本试验提取广叶绣球菌多糖时采用超声波处理，使得部分高分子量多糖组分断裂，分子质量降低，但是仍有部分分子质量处于100 u～200 ku 的范围，可能是由于其具有一定的生物活性并能够促进巨噬细胞增殖的原因。

为了进一步探讨广叶绣球菌水溶性多糖的结构与其生物活性的关系，本研究对多糖的结构进行了相应的表征，研究表明，单糖的类别和比例与其促进巨噬细胞增殖的能力密切相关，多糖中葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖含量较高[23-24]，且具有不同化学结构的单糖组成时，多糖具有良好的生物活性[19]。研究发现，滑子菇多糖的单糖组成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其具有促进巨噬细胞增殖的能力[25]。本研究中，SLP-a 主要由果糖、木糖和甘露糖组成，SLP-b 主要由葡萄糖、木糖、半乳糖和甘露糖组成，这可能也是其能够促进巨噬细胞增殖的原因之一。此外，对多糖的结构进一步分析可知，多糖分子SLP-a 和SLP-b 中有大量的游离羟基和氨基，且其糖环为吡喃环，表明SLP-a 和SLP-b 有较为稳定的化学结构。在原子力显微镜下观察可知，广叶绣球菌水溶性多糖呈现一定的链状分支构象，可以对多糖空间结构的稳定起到重要作用。由此可知，SLP-a 和SLP-b 化学结构及空间结构都较为稳定，因而可以保证其相对稳定地发挥生物学活性。而扫描电镜结果显示，SLP-a 与SLP-b 均表现为一定的网状结构，与基团发生作用时可拥有更大的接触面积。虽然本试验中SLP-b 与SLP-a 相比，在促进巨噬细胞增殖的能力上未有明显的调节趋势，但是SLP-b 质量浓度在15.625 μg/mL 时，促进巨噬细胞增殖能力最强，而SLP-a 质量浓度在31.25 μg/mL时，其促进细胞增殖能力最强。对于二者的结构及其在调节其他生物活性上的差异还有待进一步探讨。

本试验对SLP-a 和SLP-b 的结构进行了表征，且发现二者在一定浓度范围内均能促进巨噬细胞的增殖，具有潜在的免疫调节能力。但是有关SLP-a 和SLP-b 高级立体构象与生物活性的研究还未深入，还有待后续进一步研究。