多次输血尿毒症患者免疫抗-Jk3引起输血无效及家系分子生物学研究①

龚晨辉 饶美英 周 芬 余 玲 胡 芬 叶水文 (江西省南昌大学第二附属医院，南昌 330006)

Kidd血型系统诱导的同种免疫抗体是除ABO、Rh系统外引起溶血性输血反应的主要同种抗体，其血型抗原是SLC14A1基因的产物，也是红细胞膜上尿素转运蛋白。正常红细胞表达Jka或Jkb抗原，当SLC14A1基因发生变异时，可以使Jka或Jkb抗原性消失，并导致红细胞对尿素转运能力下降。因此，在传统血清学中，以2 mol/L尿素与样本红细胞反应15 min 后不溶血作为Jknull表型的筛选方法。Jknull血型经同种免疫后易产生高频抗原抗体即抗-Jk3，该抗体与所有正常表达Jka或Jkb抗原的红细胞发生凝集。近年，国内外少有此抗体引起溶血性输血反应的报道，因此本课题组对患者及其家庭成员的Kidd血型进行血型血清学检测与分子生物学分析，研究Jknull表型的分子机理和遗传背景，为此类稀有血型患者输血提供相关科学依据，同时提示需要长期输血患者的检测手段与建议，现报道如下。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 患者，女，51岁，尿毒症病史2年。因发热、头晕3 d，伴昏迷半天入院治疗，亲属叙述无输血治疗史。1 d：入院血常规检查Hb:42 g/L，申请滤白悬浮红细胞2U，胆红素未见异常。输血前检测: O型，Rh(D)阳性，抗体筛查阴性；随着患者多次输注异体红细胞后，直抗阳性逐渐增强(凝集强度越大代表效价越高);交叉配血实验结果：主侧阴性，次侧阳性。21 d: 因当地配血困难，寻求上级医院会诊。其他输血相关信息见表1。

1.1.2试剂和仪器 抗人球蛋白(抗IgG、抗C3d)检测卡(微柱凝胶法)、抗人球蛋白(抗IgG+C3d)检测卡(柱凝集法)、不规则抗体筛选红细胞试剂均为江苏力博医药生物技术股份有限公司产品；谱细胞、抗人球蛋白(抗IgG)、抗-Jka标准血清、抗-Jkb标准血清均为美国Immucor公司产品；酸放散试剂为珠海贝索生物技术有限公司产品；尿素为西陇科学股份有限公司产品，所有试剂均按试剂说明书进行操作。离心机 (KA-2200)为日本久保田公司产品；全血DNA提取试剂盒、人类红细胞稀有血型基因分型试剂盒、SLC14A1基因测序试剂盒均为江苏中济万泰生物医药有限公司产品；自动化核酸提取设备(Gene Pure Plus)、荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测系统(LineGene 9600 Plus)均为杭州博日科技有限公司产品。

1.2方法

1.2.1血清学检测 按照《全国临床检测操作规程》对标本进行血型鉴定、不规则抗体鉴定等检测[1]。直抗阳性样本按酸放散说明书进行检测。

1.2.2分子生物学分析 运用磁性微珠分离技术，采用全血DNA提取试剂盒在自动化核酸提取设备完成基因组纯化。JKA/JKB 基因分型使用人类红细胞稀有血型基因分型试剂盒，采用荧光溶解曲线法技术。Kidd基因扩增与测序分析使用Kidd测序科研试剂盒进行PCR序列特异性引物与测序引物进行分析，测序结果使用Geneious序列判读软件，将结果与参比序列(Jk*01)进行对比分析。

2 结果

2.1先证者输血记录与检验结果 患者输血前后血红蛋白(Hb)、总胆红素(TBI)、直接胆红素(DBI)、间接胆红素(IBI)检测值变化见图1。

2.2血清学试验结果 21 d样本进行毛细管离心，近心端与远心端样本的直接抗人球蛋白分型、2 mol/L 尿素溶解试验、标清定型结果见表1。

2.3不规则抗体筛选与鉴定 患者血浆样本抗筛阳性，抗体鉴定结果为高频抗体、与所有谱细胞均为4+凝集，与患者经毛细管离心后近心端样本不凝集。酸放散液与所有谱细胞均2+凝集，与患者经毛细管离心后近心端样本不凝集。

2.4分子生物学分析 所有家系成员含先证者基因分型结果皆为Jk(a-b+)。先证者测序结果为：341+12CT，342-1GA，222CA，499AG，588GG，838AA;先证者丈夫测序结果为: 499GG，588GG，838AA;先证者子代测序结果为:341+12CT、342-1GA、499AG、588GG、 838AA，测序结果见图2。根据测序结果进行先证者等位基因分析，其一等位基因为:341+12C>T，342-1G>A，588 A>G，838G>A，另一等位基因为：222C>A，499 A>G，588A>G，838G>A。先证者子代携带先证者等位基因(341+12C>T，342-1G>A，588A>G，838G>A)，见图3。

图1 先证者入院后的实验室数据和输血记录Fig.1 Proband′s lab data and transfusion record since admit to hospitalNote:IAT.indirect coombs test， DAT.direct coombs test,Major.crossm-atch major compatible， Minor.crossmatch minor compatible， LPR.leukocyte poor RBC，WRBC.washed RBC，0.Negtive;1+.agglutinating cells are in the middle and lower part of gel card;2+.agglutination cells were found in the upper,middle and lower parts of gel cards;3+.agglutination in the upper and middle part of the gel card;4+.agglutination at the top of the gel card (the higher the agglutination intensity,the higher the titer);dcp.double cell population.

表1 毛细管离心后的直抗、2 mol/L尿素和Kidd表型结果

图2 先证者的SLC14A1序列结果Fig.2 SLC14A1 sequence result in proband

图3 先证者的遗传家系图谱Fig.3 Molecular pedigree analysis of proband

3 讨论

有输血史患者一旦产生高频抗体，便不易与自身抗体区分，因为近期患者体内输入的献血员红细胞与患者免疫刺激生成的同种抗体发生凝集导致直抗阳性。先证者在高频抗体产生前Hb从42 g/L上升至输血后52 g/L，显示此时输血有效，但后续输血由于先证者近期密集输血与直抗阳性，将高频抗体误判为自身抗体[2-3]。先证者在住院第13天、20天、21天输血后未见Hb明显上升，且胆红素在1 d 内急剧升高，由此提示献血员红细胞在患者体内大量破坏，考虑患者出现由同种抗体或合并自身抗体导致的迟发型溶血性输血反应[4]。经毛细管离心试验处理样本后，患者新生成红细胞不与患者血浆发生凝集且直抗阴性，由此进行高频抗体分析[5-6]。

中国人群的高频抗体频率占所有红细胞免疫抗体频率0.05%以下，以抗-Jk3、抗-Dib、抗-P1PPk相对常见。Kidd血型刺激产生的抗体在血浆中可能迅速下降至很低或不能被检测的水平，给该类抗体检测带来一定困难[7-10]。但在过去的案例报告中，抗-Jk3不乏严重和致命的急性溶血性输血反应，也有迟发型溶血性输血反应的案例报导[11-13]。抗-Jk3仅发生在Jk(a-b-)(又称Jknull)表型人群，波利尼亚和芬兰人的Jk(a-b-)频率约为0.1%～1.4%，亚洲地区日本约为0.002%，我国开展的稀有血型筛查计划报导新疆维吾尔地区少数民族Jk(a-b-)频率为0.0063%、番禺地区50 034例无偿献血者中发现10例Jk(a-b-)，频率为0.02%，深圳地区儿童Jk(a-b-)频率为0.0196%，48 400上海地区人群中发现2例Jk(a-b-)，频率为0.0041%。

Kidd血型系统为SLC14A1基因产物，由11个外显子构成。JKA与JKB基因多态性由G838A决定第280个氨基酸为天冬氨酸形成Jka抗原、天冬酰胺形成Jkb抗原。Jknull表型的分子机制中以342-1G>A相对常见，旧称IVS5-1，该位点突变位于内含子5最后一个碱基，导致RNA剪切酶无法结合，使6外显子全片段缺失[14]。在本实验的家系调查中，先证者与其子代都发生该位点突变。而先证者另一导致Jknull的碱基突变为222C>A，即第74个氨基酸从天冬酰胺变赖氨酸。

综上所述，对长期多次输血患者进行严格执行输血前后效评价，可早期发现由输血刺激产生的同种抗体，为患者后续制定合理有效的输血策略提供依据[15-16]。虽然先证者为尿毒症患者，缺少Hb及肌酐等肾功能损害关键指标无法体现，但仍可从输血后胆红素的急剧上升发现患者存在大量红细胞破坏现象。对于需要长期多次输血患者需进行多抗原检测及抗体筛查，可保障该类患者输血安全，提升用血质量[17]。