蛋白质磷酸化对衣原体生理学影响的研究进展①

Emmanuel Wirekoh ARTHUR 王英姿 综述 周 洲 审校

(南华大学病原微生物学研究所，衡阳 421001)

衣原体(Chlamydia)是一种在全球范围内引起人和动物致病的专性胞内菌，其中肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae,Cpn)主要感染呼吸道引起肺炎、支气管炎等炎症病理反应，与肺癌、动脉粥样硬化密切相关[1-3]；鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci,Cps)通过鸟类的粪便传播至人类呼吸系统，引起肺炎[4-5]；而沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,Ct)是世界范围内引起广泛性传播感染的主要病原菌，其感染人体可引起沙眼、盆腔炎、不育症和异位妊娠等炎性疾病[6-7]。衣原体具有独特的双相发育周期，即在具有感染性的原体(elementary body,EB)和复制型的网状体(reticulate body,RB)之间相互转化[8-10]。衣原体感染开始于EB黏附至宿主细胞，接触后,其Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)主要通过分泌效应蛋白诱导EB内化形成包涵体[11]。衣原体侵入宿主细胞后，通过转运机制退出内吞途径并迁移至核周。大多数衣原体蛋白被分泌至包涵体囊腔和宿主细胞胞质，导致宿主蛋白被募集、衣原体获取营养物质、抗细胞凋亡通路的维持和调节固有免疫[12]。

磷酸化作为最常见的蛋白质翻译后修饰的方式，是指由蛋白质激酶催化的将ATP磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)上的过程，或在信号作用下结合GTP，在细胞信号转导过程中起重要作用，也是调控蛋白质活力和功能最普遍的机制。蛋白质磷酸化可通过动态调控酶活性、蛋白定位、信号转导和蛋白寡聚化在细菌感染引起致病的过程中发挥重要作用，如黏附至宿主细胞或调节信号转导[13-14]。近年来，原核生物的蛋白磷酸化因能够通过蛋白激酶和磷酸酶逆化修饰蛋白功能从而调节重要的生物学过程引起广泛关注[15]。蛋白质磷酸化可调节衣原体生理学多样性，对衣原体生长和发育具有重要影响。本文综述了目前蛋白磷酸化对衣原体生理学的可能影响，旨在更深入地探讨衣原体的致病机制。

1 蛋白质磷酸化的组成

蛋白质磷酸化包括蛋白质激酶和磷酸酶、双组分信号系统(two-component signaling systems,TCSS)及合作-开关机制3个部分[16]。蛋白质激酶是催化蛋白质磷酸化过程的酶，这类酶可以改变蛋白质、酶的构象和活性，根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类主要分为丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白质激酶、酪氨酸(Tyr)蛋白质激酶、色氨酸(Trp)蛋白质激酶和天冬氨酰基/谷氨酰基(Asn/GIn)蛋白质激酶五大类。磷酸酶与蛋白质激酶作用相反，是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，能够调控多种信号转导通路的磷酸化过程[17]。TCSS由整合膜传感器组氨酸激酶(histidine kinase,HK)和胞质应答调节因子(response regulator,RR)两部分组成，分别由两个不同的基因编码，组成1个操纵子[18]。合作开关机制(partner switching mechanisms,PSM)是指细胞在信号转导过程中起开关作用的蛋白,其能够在单独的模型中起作用[19-21]。

2 蛋白质磷酸化各组分对衣原体生理学的影响

2.1蛋白质激酶和磷酸酶对衣原体致病过程的影响 磷酸化蛋白在EB和RB之间分配不同，在EB和RB中分别含有74%和19%。EB磷酸化蛋白质主要包含参与中心和次级代谢的蛋白以及假定蛋白和毒力蛋白。虽然EB无代谢活性，但蛋白质组研究表明EB含有的参与中心和次级代谢的酶在进入宿主细胞后会发生代谢[22]。大多数EB磷酸化的代谢蛋白在RB中未被磷酸化，表明磷酸化作用可快速调节代谢酶活性。相反，RB磷酸化蛋白质组主要与蛋白质合成和折叠功能相关。

衣原体可通过T3SS和Ⅱ型分泌系统将蛋白注入包涵体囊腔和宿主细胞质[23]。目前已知4种衣原体蛋白可通过宿主激酶引起磷酸化：易位肌动蛋白募集磷酸化蛋白(TarP)、易位早期磷蛋白(TepP)、包涵体膜蛋白A(IncA)和包涵体膜蛋白G(IncG)。TarP 作为一种高分子量Tyr磷酸化蛋白存在于所有衣原体，并在衣原体入侵宿主细胞的过程中发挥重要作用。衣原体黏附于宿主细胞后，EB内的TarP通过T3SS分泌到宿主细胞质。CLIFTON等[24]证明Tarp在侵入位点被Tyr磷酸化并与肌动蛋白的募集相关，猜测其可能参与调节肌动蛋白募集反应的信号转导，而这种募集反应将促进EB进入宿主细胞致病。TepP 是继TarP后新发现的一种T3SS效应蛋白，在Ct中被称为CT875，CHEN等[25]发现并证明其在衣原体进入宿主细胞早期易位，并被Tyr磷酸化。TepP作用于TarP的下游以募集骨架蛋白，有利于在衣原体进入宿主细胞期间启动和扩增信号级联反应导致感染。衣原体Inc是衣原体基因编码、表达定位于包涵体膜上的蛋白质，其可介导衣原体与宿主细胞相互作用从而影响宿主细胞的生物学功能。ROCKY等[26]发现Cps的IncA是一种由宿主细胞酶磷酸化的Ser/Thr磷蛋白，在释放至包涵体后被宿主激酶磷酸化，但IncA在衣原体感染过程中发挥何种作用有待进一步研究。SCIDMORE[27]等证明IncG的表达在内化后2 h内可以被检测到，14-3-3β蛋白是第一个与Ct的IncG相互作用的磷酸Ser结合蛋白，但IncG在Ct发病机制中的作用尚不明确。

近年来，Ser/Thr/Tyr的蛋白质磷酸化由于可调节细菌生理学的多样性而获得了广泛认识[14,28]。其中，Ser/Thr磷酸化通常由Hank′s型激酶介导，其与同源蛋白磷酸酶起作用并可能引起全面蛋白磷酸化，Tyr磷酸化通常由细菌酪氨酸激酶(bacterial tyrosine kinases,BY)介导。这些酶以ATP为磷酸供体，P-Ser/Thr/Tyr残基形成更稳定的酯键，需要特定的蛋白磷酸酶与其同源激酶一起发挥作用[29]。蛋白磷酸酶分为两个超家族：蛋白Ser/Thr磷酸酶(protein Ser/Thr phosphatases,PSPs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)，PSPs可进一步细分为磷蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases，PPP)和金属依赖性蛋白磷酸酶(metal-dependent protein phosphatases)[30]。WHITMORE等[31]证明BY激酶和PTP可利用宿主细胞蛋白作为底物导致细菌致病。Ct的CTL0511作为一种金属依赖性蛋白磷酸酶，具有广泛的底物特异性，证实了沙眼衣原体中存在可逆磷酸化网[32]。CLAYWELL等[32]和GLAYWELL等[33]在Ct的EB和RB中均检测到磷酸酶活性，这对衣原体代谢和致病至关重要，并且能够使色氨酸磷酸化(P-Ser)、苏氨酸磷酸化(P-Thr)和酪氨酸磷酸化(P-Tyr)去磷酸化。此外，CppA是金属依赖性蛋白磷酸酶的蛋白磷酸酶2C型(type 2C Ser/Thr protein phosph-atase,PP2C)亚家族成员，这项研究突出了CppA作为未来治疗策略的新靶点并支持为衣原体和其他致病细菌设计更有效的PP2C磷酸酶抑制剂的可行性。CppA的底物易与Cpn的PknD磷酸化Tyr残基结合,此结合特性支持衣原体中P-Tyr的存在[34]。因此，P-Tyr是否存在于其他衣原体中或是否仅限于Cpn仍有待进一步研究。

所有衣原体均编码2种Hank′s型激酶，即分别存在于衣原体质膜的Pkn1、内膜的PknD及T3SS分泌的假定激酶Pkn5。JOHNSON等[35]证明Cpn的PknD在Thr/Tyr残基上自磷酸化并磷酸化T3SS结构蛋白CdsD上的Ser/Tyr残基，这是对Ser/Thr/Tyr残基具有氨基酸特异性的细菌蛋白激酶的首次证明，同时也是第1个预测Ⅲ型分泌结构蛋白磷酸化的研究。PknD/Pkn1/CppA缺乏无义突变表明这些酶可能是衣原体生长所必需的[36]。抑制PknD显著影响Cpn生长，进一步表明蛋白质磷酸化是衣原体生长发育的关键环节，且这些酶可能作为衣原体引起疾病的治疗靶标发挥作用[37]。Ct的Pkn1和PknD在Ser/Thr残基上自磷酸化并相互作用，表明Pkn1和PknD可交叉调节[38]。此外，包涵体膜蛋白IncG为Ct的Pkn1底物，CdsD作为Cpn的PknD底物，猜测Pkn1和PknD在宿主和衣原体相互作用中作为潜在介质从而影响衣原体发育和致病过程[35,38]。虽然Pkn1可在体外磷酸化IncG，但IncG可能在体内被宿主激酶磷酸化，类似于IncA。Pkn5因缺乏保守的催化残基被认为是假定激酶，其在含T3SS基因的操纵子中被编码，并在沙门氏菌替代T3SS测定中作为T3SS底物[39]。Cps在Pkn5的保守Ser残基上有自由基突变，是宿主蛋白可能的磷酸化结合位点，从而在鼠肺炎模型中毒性减弱[40]。Cpn的Pkn5定位于包涵体膜，将进一步支持其作为效应蛋白的作用。

2.2TCSS对衣原体的转录调节 TCSS可通过适应性应答对不断变化的环境进行调节，这些信号系统主要存在于衣原体和其他专性胞内寄生菌中。pH、温度、渗透压等条件的改变可导致HK在保守的组氨酸残基上自磷酸化，随后磷酸转染至天冬氨酸残基上同源RR的接收结构域。RR通过其输出结构域寡聚化并与DNA结合调节转录[41]。衣原体含有1个完整的TCSS和1个独立的RR，其可能调节衣原体对环境的适应性应答，从而影响发育过程[42]。TCSS与σ因子通过磷酸化共同参与衣原体发育过程的转录调节，并将参与的基因分别命名为CtcB与CtcC。CtcB与CtcC在衣原体发育晚期表达，可能与EB和RB的重组相关，并进一步影响衣原体黏附和入侵。而在衣原体EB中，磷酸化位点的CtcB是否影响转录功能尚不清楚[43]。CtcB与CtcC如何调节衣原体生理学过程有待进一步研究。

2.3合作开关机制对衣原体的转录调节 细菌除通过双组分信号系统进行转录调节外，还可通过合作-开关机制(PSM)调节。衣原体可编码σB型PSM的调控因子(RsB)，其PSM包括1个已确定的传感器磷酸酶RsbU、1个假定的传感器磷酸酶CT_589、2个双抗σ因子、RsbV1和RsbV2及抗σ因子RsbW[20]。σ66作为衣原体调控管家基因转录的主要σ因子，主要受PSM调控。当RsbV1在Ct中过表达，σ66调控的基因的转录表现为上调且细胞生长数增加，而当RsbW过表达或当RsbV1失活时则恰好相反。RsbW和RsbU能够控制RsbV1的磷酸化状态，但RsbW磷酸化的RsbV2不能被RsbU去磷酸化[44]。因此，RsbV2的作用以及是否存在RsbW和RsbV2的其他靶标仍有待探究。

3 结语

与多数其他细菌相反，蛋白质激酶、磷酸酶和底物似乎不在衣原体的操纵子内编码，导致磷蛋白网络的定位变得复杂。尽管衣原体蛋白激酶、磷酸酶、TCSS和PSM的存在已经得到证实，但其在体内发挥的作用仍不明确。近年来，可用于衣原体的遗传学方法迅速增加，用于研究磷酸化蛋白质组和转录组的方法可使研究者对衣原体生理学和发病机理有更深层次的理解。此外，由于蛋白质磷酸化对细菌生存和致病有重要影响，蛋白磷酸化如何促进细菌和宿主间的动态相互作用将成为未来研究的重点。