细胞外核苷酸对免疫细胞的调节作用①

王秋吉 杨启鑫 柴艳敏 单春华

(东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040)

核苷酸是核酸的组成成分，随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞核及胞质中，参与生物体的遗传、发育、生长等基本生命活动。核苷酸不仅在细胞内具有重要作用，在细胞外空间同样发挥重要作用。一定条件下细胞会主动释放核苷酸到胞外空间，或在组织受损时泄露到胞外空间，这类核苷酸称为胞外核苷酸[1]。胞外核苷酸的浓度由定位于细胞膜的磷酸水解酶调节。不同浓度的胞外核苷酸，特别是胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)与不同的嘌呤受体相互作用调节多种生理和病理过程，是广泛调节神经系统、血液系统、免疫系统等功能的重要信号[2]。免疫细胞也会主动释放ATP，且几乎所有免疫细胞都表达嘌呤受体。胞外ATP在炎症、凋亡或坏死等条件下浓度升高，作为危险相关模式分子调节免疫细胞功能，发挥二次信号作用[3]。胞外ATP可以有效调节巨噬细胞、树突状细胞(dentritic cells,DCs)、中性粒细胞、酸性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞的生理功能，与细胞迁移、趋化性、细胞因子释放、细胞成熟、细胞毒性等过程相关[4]。

1 胞外核苷酸的释放及浓度调节

胞外核苷酸的释放有主动释放和被动释放两种方式。主动释放受多种因素调节，通过胞吐作用和质膜通道完成，而被动释放不受控制，是由细胞膜破裂造成的。

细胞受到刺激活化或发生凋亡时，可通过胞吐作用主动释放ATP，如神经元细胞、血小板、淋巴细胞、肥大细胞、内皮细胞等将ATP储存在细胞囊泡中，囊泡与细胞膜融合将内容物释放到胞外空间，通过胞吐作用主动释放ATP[5]。细胞也可以通过离子通道和孔道两种质膜通道主动释放ATP[6]。离子通道蛋白主要有大离子通道蛋白和体积调节型离子通道蛋白。内皮细胞、胎盘细胞及多种免疫细胞在渗透性肿胀和缺氧期间通过大离子通道蛋白主动释放ATP，受到渗透性肿胀刺激后，内皮细胞和巨噬细胞也通过体积调节型离子通道主动释放ATP。参与细胞主动释放ATP的孔道蛋白有泛素和连接蛋白两种。免疫细胞在受到缺氧或细胞凋亡的刺激时，会通过泛素主动释放ATP[6]。而细胞膜去极化、胞外Ca2+浓度降低和促炎因子刺激时，可诱导血管平滑肌和内皮细胞等通过定位于非质膜连接区域的连接蛋白通道主动释放ATP。同一细胞可以同时通过多种途径主动释放ATP[6]。而细胞坏死时，由于细胞膜破裂，细胞内部的DNA、RNA等泄露到胞外空间，被水解为胞外核苷酸。

释放于胞外的核苷酸浓度受酶调节，参与胞外核苷酸和核苷浓度调节的酶主要有碱性磷酸酶、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶家族(ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase，e-NTPDases)、碱性磷酸酶和5′-外核苷酸酶(ecto-50-nucleotidase，NT5E/CD73)、外核苷酸焦磷酸酶(ecto-nucleotide pyrophosphatases，ENPPs)、腺苷脱氨酶、NAD糖水解酶、CD38/NADase、二核苷酸聚磷酸水解酶、腺苷酸激酶、核苷二磷酸激酶和潜在的胞外-F1-fo ATP合成酶[7]。e-NTPDases、碱性磷酸酶和CD73主要调节胞外ATP的浓度[7]。 e-NTPDases中主要发挥作用的是NTPDases 1、2、3和 8。 NTPDase1也称为CD39在各种淋巴细胞和静息血管内皮上表达。CD39和碱性磷酸酶具有同样的功能，可以将胞外ATP水解为ADP和AMP。CD73进一步将AMP水解成腺苷，腺苷通过腺苷脱氨酶降解为肌苷或通过核苷转运蛋白转运到细胞内[6]。ENPPs也是代谢胞外核苷酸的重要水解酶，可以水解ATP、GTP、UTP和CTP生成对应核苷以及磷酸和焦磷酸，也可以水解UDP-sugars生成UMP和sugar-1P，还可以水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、ADP核糖和二核苷酸多磷酸盐[7]。

2 胞外核苷酸受体

胞外核苷酸与不同的嘌呤受体(purines receptors,P受体)结合，启动不同的信号转导途径。P受体包括2个家族：识别腺苷的P1受体和主要识别ATP、ADP、UTP和UDP 的P2受体[4]。

P1受体是G蛋白偶联受体，有4个亚型分别是高亲和力受体A1、A2A和低亲和力受体A2B、 A3。P1受体有腺苷酸环化酶活性，调节环状AMP(cyclic AMP，cAMP)。A2A和A2B激活腺苷酸环化酶，而A1和A3抑制腺苷酸环化酶。中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、T细胞等多种免疫细胞表达P1受体，影响cAMP的生成[3]。

P2受体有配体门控离子通道型受体(P2X受体) 和G 蛋白偶联型受体(P2Y受体)2种类型。P2X受体是以ATP为唯一配体的质膜通道，介导细胞中多种阳离子的流入或流出如Na+、K+、Ca2+，在人类和啮齿动物中共有7种亚型P2X1～P2X7。P2X受体以三聚体的方式排列在离子通道周围，与3个ATP结合打开离子通道，诱导丝裂原活化蛋白激酶途径等的激活[3]。P2Y受体以ATP、ADP、UTP、UDP和UDP-sugars为配体(表1)，激活后可以调节腺苷酸环化酶磷脂酶C和离子通道等信号传导途径，有8种亚型：P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13和P2Y14[4]。

3 胞外核苷酸对免疫细胞功能的调节

不同的胞外核苷酸与特定免疫细胞表达的不同受体结合发挥不同作用。胞外ATP与巨噬细胞的P2X受体相互作用，调节巨噬细胞分泌细胞因子或增强吞噬作用。胞外核苷酸对DCs功能的调节受浓度和刺激时间的影响。胞外ATP对中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的趋化性和迁移具有调节作用。胞外ATP对自然杀伤(natural killer,NK)细胞和T细胞的活性及稳定性具有调节作用。

3.1胞外核苷酸对巨噬细胞的调节 巨噬细胞具有摄取处理外来物质和坏死细胞的吞噬功能，同时还可以产生多种细胞因子参与抗原呈递和免疫调节。胞外ATP可以刺激巨噬细胞分泌多种细胞因子或增强其吞噬作用以适应外部微环境的改变。

胞外ATP与巨噬细胞上的P2X7受体结合使K+外流，触发NLRP3(natch domain-,leucine-richrepeat-,PYD-containing protein 3，NLRP3)炎症小

表1 P2Y受体及其配体

体聚集[8]，NLRP3炎症小体促进半胱氨酸蛋白酶1前体成为有活性的半胱氨酸蛋白酶1，将IL-1β前体和IL-18前体转化为活性细胞因子[9]。敲除小鼠巨噬细胞表面的P2X7受体，NLRP3炎症小体、IL-1β和IL-18分泌减少[10]。胞外ATP通过与P2X7受体相互作用也可以刺激巨噬细胞产生活性氧，激活胞外调节蛋白激酶和半胱氨酸蛋白酶1，加工IL-1β前体和IL-18前体[11]。此外毫摩尔浓度的胞外ATP还可以刺激巨噬细胞产生IL-1α、IL-6、TNF-α[4]。低摩尔浓度的胞外ATP与P2Y11受体相互作用，通过依赖于cAMP的蛋白激酶A或由cAMP直接激活的交换蛋白直接或间接增加cAMP负向调节反应，抑制炎症细胞因子产生并同时上调抗炎细胞因子IL-10的表达[12]。细胞凋亡时释放少量的胞外核苷酸与巨噬细胞的P2X1受体或P2X3受体相互作用，上调整合素1和波连蛋白受体在巨噬细胞中的表达，增强巨噬细胞与凋亡小体的结合能力，从而增强巨噬细胞的吞噬作用[13]。而细胞坏死时泄露的大量胞外核苷酸只刺激巨噬细胞的促炎活性不增强其吞噬作用。抑制胞外ATP与巨噬细胞的嘌呤受体结合，可显著降低HIV病毒的复制率[3]。

3.2胞外核苷酸对DCs的调节 树突状细胞(dendritic cells，DCs)是激活T细胞最有效的抗原呈递细胞。DCs的激活是启动先天免疫的关键环节。不同浓度胞外核苷酸及不同刺激持续时间对DCs的影响是不同的，低浓度的胞外ATP促进DCs成熟并迁移到淋巴结，刺激T细胞分化。高浓度胞外ATP增强DCs的促炎活性。其他胞外核苷酸也可以调节DCs的功能[4]。

低浓度的胞外ATP慢性刺激可促进DCs成熟，增强募集Th2细胞的能力，引发2型免疫应答。胞外ATP与其他刺激DCs成熟的因子如细菌内毒素、脂多糖等共同存在时，IL-1b、IL-1a、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α的表达受到抑制，IL-1受体拮抗剂和IL-10的表达不受影响，从而增强T辅助细胞的分化能力[14]。胞外ATP也会影响DCs趋化因子受体的表达。胞外ATP与DCs相互作用下调炎症趋化因子如CC趋化因子受体5的受体，上调淋巴趋化因子如CXC趋化因子受体4和CC趋化因子受体7[15]。淋巴趋化因子的上调有利于淋巴结定位及增强DCs与T细胞相互作用的能力。此外胞外ATP也影响DCs分泌趋化因子。胞外ATP促进DCs分泌淋巴趋化因子CCL22，抑制磷酸酯多糖刺激的炎症趋化因子CXCL10和CCL5的分泌[15]。趋化因子释放的转变有利于Th2的募集。因此长期低浓度胞外ATP对DCs，的成熟具有较强的调节活性，通过增强DCs在淋巴结中的定位能力和募集Th2细胞，从而启动2型免疫反应。高浓度胞外ATP和细菌病原体共同刺激DCs，胞外ATP加速IL-1b前体的成熟，显著提高DCs的促炎活性[16]。

胞外UDP通过抑制脂多糖诱导的核因子-κB 的激活，抑制 DCs 的成熟及分泌IL-12、IL-23，从而抑制了DCs 介导的 Th1 和 Th17 细胞的分化，缓解自身免疫性疾病[17]。胞外ADP抑制DCs的成熟和吞噬功能，UTP促进DCs释放细胞因子[18]。

3.3胞外核酸对的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的调节 中性粒细胞是高速运动的吞噬细胞，可以快速从血液循环中迁移，负责入侵微生物的初始清除，是先天性免疫重要的效应细胞。胞外核苷酸对中性粒细胞细胞迁移、分泌细胞因子、凋亡及吞噬功能具有调节作用。在炎症细胞应激/损伤/死亡血小板聚集刺激下产生的N-甲酰基肽激活中性粒细胞表面的甲酰肽受体，使中性粒细胞通过泛素连接蛋白1或连接蛋白43释放ATP[18]。这一部分胞外ATP与其他细胞释放的胞外ATP共同作用于中性粒细胞表面的P2Y2受体，打开Ca2+通道聚集肌动蛋白，促进中性粒细胞向损伤部位迁移。同时作为受到脂多糖刺激的Toll样受体的第二阶段反应，刺激中性粒细胞分泌IL-8，分泌的IL-8反过来诱导其他中性粒细胞的趋化性[19]。胞外ATP也会作用于中性粒细胞表面的P2Y11受体延长细胞凋亡周期[20]。胞外ATP和ADP激活巨噬细胞表面分子，刺激中性粒细胞的吞噬作用，也会在病原体刺激之前抑制中性粒细胞的吞噬功能[21]。这种抑制作用在抑制噬血细胞综合征等病理条件下发生的过度吞噬作用有重要意义。

嗜酸性细胞是粒细胞白细胞，可以从循环中募集到炎症区域，调节免疫反应。嗜酸性粒细胞可以由尿酸钠晶体诱导释放自分泌ATP，这些自分泌胞外ATP作为正反馈信号与嗜酸性粒细胞上的P2受体相互作用。胞外ATP调节嗜酸性粒细胞分泌细胞因子及其趋化性和迁移。胞外UTP和ADP以浓度依赖性的方式诱导嗜酸性粒细胞快速、短暂地聚合肌动蛋白，调节嗜酸性粒细胞向炎症组织迁移[22]。胞外ATP与人嗜酸性粒细胞表达的P2Y2受体结合，释放嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、IL-6、IL-8，与P2X1，P2X7和P2Y6受体相互作用释放IL-8[4]。此外胞外ATP与内皮细胞表达的P2Y2受体相互作用可以调节嗜酸性粒细胞的趋化性。胞外ATP与定位于内皮细胞的P2Y2受体相互作用，使内皮细胞表达血管细胞黏附分子1。血管细胞黏附分子1与嗜酸性粒细胞表达的α4β1整合素结合，诱导嗜酸性粒细胞的迁移和黏附[22]。

3.4胞外核苷酸对淋巴细胞的调节 胞外ATP可以调节T辅助细胞(T helper cells，Th细胞)的增殖和CD62L的释放。在应激信号刺激和主要组织相容性复合物Ⅱ类与T细胞受体结合的共同作用下，Th细胞通过泛素1释放ATP。自分泌的胞外ATP与Th细胞表达的P2X1、P2X4和P2X7受体作用，调节IL-2的分泌和Th细胞的增殖[23]。胞外ATP与P2X7受体集合还可以促进Th细胞释放CD62L[4]。CD62L的释放与T细胞活化有关[4]。

胞外ATP调节调节型T细胞的稳定性及维持免疫耐受性。IL-6促进调节型T细胞释放ATP。自分泌的胞外ATP与调节型T细胞的P2X7受体结合，促进调节型T细胞分化为分泌IL-17的Th17细胞[24]。主要组织相容性复合物Ⅱ类与调节型T细胞的T受体结合后，上调特异性转录因子Foxp3，增强了CD39的表达，促进胞外ATP的水解生成腺苷，腺苷激活T细胞表达的A2受体抑制IL-2的产生，使活化的调节型T细胞以自体方式消除P2X7介导的功能和稳定性的抑制[25]。而胞外ATP与P2X7受体结合后可以抑制特异性转录因子Foxp3，抑制调节型T细胞的抑制潜能和稳定性，维持免疫耐受性[4]。胞外ATP上调参与免疫抑制和耐受的凝血酶敏感素-1和吲哚胺2，3-双加氧酶的表达，凝血酶敏感素-1下调IL-12，抑制T细胞增殖，负调节获得性免疫[20]。GTP和核苷浓度的改变也会抑制T细胞增殖[26]。

胞外ATP是NK细胞活性的调节剂，即可以抑制NK细胞的增殖和IFN-Y的分泌[24]。又可以阻断趋化因子(C-X3-C基序)配体1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)介导的NK细胞毒性和趋化性。胞外ATP与NK细胞表面的P2Y11受体相互作用增加趋化因子和对趋化因子(C-X-C基序)配体12[chemokine (C-X-C motif) ligand 12，CXCL12]的趋化性，同时抑制CX3CR1诱导的趋化性和NK细胞杀伤能力[25]。胞外UDP通过抑制IL-15激活雷帕霉素靶蛋白(m-TOR) 信号通路，影响Th1细胞分化，进而抑制 NK 细胞杀伤能力[16]。胞外ATP和相关的腺嘌呤核苷酸在降低NK细胞毒性中发挥作用。胞外ATP通过抑制NK细胞增殖，抑制NK细胞对K562靶细胞的细胞毒性。细胞外ATP还可以通过激活P2Y11受体调节NK细胞的细胞毒性[25]。

4 总结与展望

综上所述，核苷酸不仅是核酸的基本单位，也在胞外空间调节细胞间信息交流。胞外核苷酸与P2受体结合，激活免疫细胞促进炎症细胞的迁移、增殖、分化和释放多种炎症介质。炎症条件下，细胞不仅应激或死亡后被动释放核苷酸，也会通过非溶解机制主动释放核苷酸。在免疫系统中胞外核苷酸是损伤相关模式分子，调节巨噬细胞、DCs、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的功能。炎症和免疫反应在多种人类疾病中起关键作用，而胞外核苷酸又可以调节炎症和免疫应答。胞外核苷酸是治疗多种疾病重要的药理学靶标，同时P2受体靶向药物也为治疗炎症疾病提供了潜在治疗剂。对于胞外核苷酸调节免疫应答机制的深入研究具有深远的生物学和药理学意义。