基于斑马鱼在体模型高效筛选补骨脂配伍减毒研究

宁青，刘中秋，韦英杰,胡明

(1.广州中医药大学国际中医药医学转化研究所，广东 广州 510006；2.江苏省中医药研究院，国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏 南京 210028)

补骨脂是具有补肾壮阳、温脾止泻之效的传统中药，临床应用广泛，2015年版《中国药典》收载含补骨脂的成方制剂达41种[1]。随着补骨脂及其制剂的广泛应用，临床上陆续出现肝损伤病例报道[2-4],其潜在肝毒性风险逐渐显现。国家药品监督管理局已先后通报了含补骨脂的制剂导致肝损伤的不良反应[5-7]。在2017版《医保目录》中也报道了含补骨脂的中成药导致的42例肝损伤病例[8]。早在2009年Cheung等[9]报告指出3例急性肝炎患者均使用补骨脂注射剂或含有补骨脂的方剂，提出补骨脂素及其相关化学品可能导致肝毒性，并指出与其他草药同煎可能会导致较高浓度的有毒成分和更严重的肝损伤。补骨脂化学成分复杂，主含香豆素类、黄酮类和补骨脂酚等成分，其中补骨脂素是补骨脂中主要活性成分，亦被认为是主要的毒性成分。

王永炎和张伯礼提出了以组分配伍研制现代中药的有效组分配伍研究新策略[10]，中药配伍减毒是方剂的特色优势，是中医方剂理论的重要组成部分之一，对临床合理用药有重要指导意义。配伍减毒也是最常用的减毒方法之一，其现代研究是国家中医药现代化发展战略的重要研究内容[11]。如何科学合理地进行配伍减毒研究是目前大家都较为关注的问题。现有体内外毒性评价法均存在相应弊端：体内毒性实验周期长、成本高、化合物用量大，难以进行大规模高效的毒性筛选；体外细胞实验快速，但实验结果常常与体内实验有较大差别。在此基础上，本文尝试采用斑马鱼在体模型进行补骨脂配伍减毒筛选研究。斑马鱼是近年来进行药物在体高通量筛选、毒性和代谢等研究的热门模式生物[12-14]。斑马鱼毒性评价法已在国内外广泛用于药物的安全性评价[15-16]。本文以补骨脂素为目标毒性成分，研究临床不同药味配伍补骨脂素的变化来快速筛选目标减毒药味及成分，并从转录组水平揭示桃叶珊瑚苷配伍补骨脂素减毒的分子机制。

1 材料

1.1 实验动物

实验用斑马鱼成鱼(南京尧舜禹生物科技有限公司)为德国Tuebingen品系斑马鱼，胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。在(28±0.5)℃条件下用养鱼用水孵育胚胎(养鱼用水水质:每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～510 μS/cm，pH为6.9～7.2)。

1.2 药品与试剂

1.2.1 试剂 补骨脂素购自国家食品药品检定研究院(Psoralen，PS，纯度98%，批号：110739-201617)；桃叶珊瑚苷购自南京狄尔格医药科技有限公司(Au，纯度>98%，批号:D1905130138030113)；培养基母液：5 mmol/L NaCl,0.17 mmol/L KCl,0.33 mmol/L CaCl2,0.33 mmol/L MgSO4；RNeasy microarray tissue mini kit购自Qiagen(批号：73304)；NEBNext Ultra Ⅱ RNA购自NEB(批号：E7770L)；Ampure XP购自贝克曼(批号：A63880)；QubitTM1× dsDNA HS Assay购自Thermo Fisher(批号：Q33233)； 琼脂糖购自索来宝(批号：YZQZT)；TBE缓冲液购自索来宝(批号：T1051)；GelGreen染料购自Biotium(批号：41013)；DNA loading buffer ×6购自索来宝(批号：D1010)；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.2.2 药材 见表1。

1.3 仪器

尼康ECLIPSE-Ci正置显微镜(日本Nikon公司)；尼康DS-Fi3显微镜相机(日本Nikon公司)；SPX-80生化培养箱(宁波海曙赛褔实验仪器厂)；Organomation N-EVAP TM 112氮吹仪(美国Origanomation Associates公司)；KQ3200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Mettler Toledo ABMS105DU分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

表1 药材来源

2 方法

2.1 供试液的配制

2.1.1 补骨脂素供试液的制备 精密称取适量补骨脂素加入适量DMSO溶解，配制成补骨脂素母液，再用斑马鱼培养基分别稀释成25、50、100 μmol/L的补骨脂素供试药液，供斑马鱼毒性评价用。

2.1.2 不同药味供试液的制备 通过文献研究及课题组前期试验结果[17-19]，筛选了女贞子、桑寄生、五味子、骨碎补、杜仲、菟丝子及淫羊藿7味中药进行配伍研究。分别称取补骨脂、女贞子、桑寄生、五味子、骨碎补、杜仲、菟丝子及淫羊藿饮片适量，加10倍量水提取2次，每次1 h，合并煎液，滤过，分装药液，每管药液相当于100 mg原生药量，氮气吹干，临用时加10 mL斑马鱼培养基溶解，作为母液，供斑马鱼毒性评价试验用。

2.1.3 不同药味与补骨脂素配伍样品的制备 取不同药味供试液母液0.25 mL，加入一定量补骨脂素，采用斑马鱼培养基配制成25、50、100 μmol/L(以补骨脂素计)的供试液，供斑马鱼毒性评价试验用。

2.1.4 桃叶珊瑚苷与补骨脂素配伍样品的制备 分别精密称取补骨脂素和桃叶珊瑚苷适量加入适量DMSO溶解，配制成补骨脂素和桃叶珊瑚苷母液，再用斑马鱼培养基配制成高(补骨脂素200 μmol/L，桃叶珊瑚苷100 μmol/L)、中(补骨脂素150 μmol/L，桃叶珊瑚苷75 μmol/L)、低(补骨脂素100 μmol/L，桃叶珊瑚苷50 μmol/L)浓度配伍溶液，供斑马鱼毒性评价以及RNA-Sep使用。

2.2 实验方法

2.2.1 斑马鱼毒性评价试验 胚胎由斑马鱼成鱼自然交配产生，将胚胎放置于斑马鱼培养基中，在(28.0±0.5)℃培养箱中培养24 h。取受精后1 d(1 dpf)斑马鱼胚胎，置24孔板中，每孔8个胚胎，每组16个胚胎，分别暴露于不同质量浓度的供试液中，每孔2.0 mL溶液，用培养基为对照组。以卵凝结、心脏停跳作为死亡终点，每天计数胚胎和/或幼鱼死亡数量，显微观察幼鱼的行态/形态，并于3 dpf时拍照，一直记录到6 dpf。

2.2.2 RNA-Sep测序 胚胎由斑马鱼成鱼自然交配产生，将胚胎放置斑马鱼培养基中(28.0±0.5)℃培养箱中培养24 h。取受精后1 d(1 dpf)斑马鱼胚胎，置6孔板中，每孔20个胚胎，每组40个胚胎，分别暴露于不同的供试液中，每孔5.0 mL溶液，分别设置对照组(培养基)、补骨脂素组(补骨脂素)、配伍组(补骨脂素与桃叶珊瑚苷配伍)，以卵凝结、心脏停跳作为死亡终点，每天将死亡的胚胎取出,直到6 dpf，将未死亡的样品采用标准提取方法提取RNA，构建文库。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。

2.3 数据分析

斑马鱼毒性评价试验利用数据统计软件SPSS20.0计算2～6 dpf的斑马鱼半数死亡浓度(LC50)。RNA-Sep测序数据使用HISAT2软件进行mapping。参考基因组为Zebrafish(Danio rerio,GRCz11)，所用的软件为HISAT2。

3 结果

3.1 不同药味提取液对斑马鱼的影响

斑马鱼受精3 dpf后孵化成幼鱼，各脏器发育基本完全，鱼体透明，在载玻片上易侧卧，显微镜下检视脏器形态清楚、直观。斑马鱼经过不同药味提取液暴露后，对3 dpf斑马鱼胚胎及幼鱼进行动态检视，形态结果见图1，致死率结果见图2。

形态结果表明，与培养基组比，不同药味提取液对斑马鱼影响不一，在相同浓度条件下，杜仲、桑寄生、骨碎补对斑马鱼影响最小，女贞子、菟丝子其次，淫羊藿、五味子影响最大。淫羊藿1 500、2 000、3 000 μg/L 3组幼鱼(3 dpf)卵黄囊吸收延滞且肿大，心包肿大，眼睛变小，脊柱弯曲，呈显著中毒表现。五味子组在1 000、2 000 μg/L浓度下，心包开始逐渐肿大；在2 000、3 000 μg/L浓度下，幼鱼全部死亡。菟丝子500 μg/L及以上组卵黄囊吸收延滞且肿大，心包肿大。桑寄生组2 000 μg/L及以上组卵黄囊颜色稍发黑，形态变化不明显。杜仲各浓度对幼鱼形态无变化。从形态上分析，毒性影响大小依次为：五味子>淫羊藿≈菟丝子>女贞子>骨碎补>桑寄生>杜仲。

致死率结果表明，女贞子、杜仲各组中未见死亡；骨碎补3 000 μg/mL组中，死亡率小于20%，其他各浓度组未死亡。相关文献表明死亡率小于20%的给药浓度为安全浓度[20]。而菟丝子、淫羊藿和桑寄生给药浓度1 500 μg/mL以上组中，死亡率大于20%，显示有一定毒性。从致死率结果分析，毒性大小依次为五味子>淫羊藿>菟丝子>桑寄生>骨碎补>女贞子>杜仲。

图1 不同药味提取液对斑马鱼形态的影响

图2 不同药味作用斑马鱼的给药时间-剂量-死亡率关系及 LC50值

3.2 不同药味提取液与补骨脂素配伍对斑马鱼的影响

补骨脂素被认为是补骨脂中主要的毒性成分，因此我们以补骨脂素为研究对象，首先研究了补骨脂素单体对斑马鱼胚胎的毒性影响，继而采用不同药物提取液在安全浓度范围内与之配伍，观察配伍后药液对斑马鱼的影响，结果见图3～4。

图3 不同药味提取液与补骨脂素配伍对斑马鱼的影响

图3结果表明：补骨脂素单用后，斑马鱼幼鱼(3 dpf)卵黄囊明显肿大，头颈弯曲，眼睛变小，呈明显中毒表现；补骨脂素与杜仲、女贞子、桑寄生提取液配伍后，可明显改善鱼脏器变形，从行态/形态上有显著减毒效果；骨碎补次之；补骨脂素配伍五味子、菟丝子、淫羊藿提取液后，未见毒性减小。配伍减毒效果从大到小依次为：杜仲>桑寄生>女贞子>骨碎补>淫羊藿>菟丝子>五味子。

图4结果表明，补骨脂素低浓度25 μmol/L组中未见死亡；50 μmol/L组中，死亡率小于20%，而高浓度100 μmol/L组中，给药4 d后于5 dpf时死亡率超过50%。不同药味提取液与其配伍后发现，杜仲+补骨脂素、女贞子+补骨脂素、桑寄生+补骨脂素3组在不同浓度给药期间均未见鱼死亡，提示这3种药味可以有效地减轻补骨脂素的毒性。骨碎补+补骨脂素组出现中浓度死亡，但死亡率低于20%；菟丝子+补骨脂素、淫羊藿+补骨脂素、五味子+补骨脂素这3组在中、高浓度下，都会导致斑马鱼的死亡，并未有效地降低补骨脂素的毒性。

综合不同药味提取液以及不同药味提取液配伍补骨脂素对斑马鱼行态/形态、给药时间-剂量-死亡率结果，杜仲、女贞子、桑寄生提取液配伍后具有一定的减毒作用，其中杜仲的效果最优；骨碎补配伍后对毒性影响较小，菟丝子、五味子、淫羊藿配伍后加大了对斑马鱼的毒性影响。

3.3 杜仲活性成分桃叶珊瑚苷与补骨脂素配伍对斑马鱼的影响

为探讨杜仲配伍补骨脂素减毒作用可能的机制，在课题组前期研究基础上，选择杜仲中活性成分桃叶珊瑚苷与补骨脂素配伍，观察桃叶珊瑚苷与补骨脂素配伍后对斑马鱼的影响，结果见图5。给药结束后，将未死亡的斑马鱼样品采用标准提取方法提取RNA，进行RNA-Sep测序研究。

图5结果表明，与培养基组相比，补骨脂素100、150、200 μg/mL组幼鱼(3 dpf)卵黄囊、心包明显肿大，身体变短，眼睛变小、颜色变浅；200 μg/mL组幼鱼(3 dpf)身体弯曲显著；均呈明显中毒表现。加入桃叶珊瑚苷配伍后，100、150 μg/mL组幼鱼(3 dpf)未见明显改变；200 μg/mL组幼鱼(3 dpf)心包、卵黄囊稍微肿胀，不明显，中毒表现较补骨脂素组得到全面显著改善。图6结果表明，补骨脂素单用情况下，给药72 h后，100、200 μg/mL组鱼卵6.25%死亡；给药96 h后，200 μg/mL组鱼卵100%死亡；给药12 h后，100 μg/mL组鱼卵75%死亡，150 μg/mL组鱼卵93.75%死亡。配伍桃叶珊瑚苷之后，100、150 μg/mL浓度组无死亡；给药120 h后，200 μg/mL浓度组鱼卵25%死亡。补骨脂素配伍桃叶珊瑚苷后的毒性较单用补骨脂素时显著降低，提示配伍后有显著减毒的效果。

图5 桃叶珊瑚苷与补骨脂素配伍对斑马鱼的影响

图6 桃叶珊瑚苷配伍补骨脂素作用斑马鱼的给药 时间-剂量-死亡率关系

3.4 桃叶珊瑚苷与补骨脂素配伍RNA-Seq结果分析

3.4.1 不同组RNA-Seq数据差异分析 对照组、补骨脂素组和配伍组RNA-Seq的PCA如图7A显示，对照组与另2组差异较大，而补骨脂素组、配伍组2组间PC1(占57.19%)相似，仅存在PC2(占42.8%)的差异，3组在转录组表达特征上明显不同。相关性系数，如图7C所示，对照组与其他2组相关性低，而给药2组相关性较高但有差别。图7B、D～E展示了所有转录组的总体分布，以小提琴图、密度图、箱线图展示3组间转录组分布趋势相近，但存在部分转录本的差异。火山图(图7G～I)和热图(图7F)体现3组间基因转录水平上的差异，补骨脂素组和配伍组组间上调或下调基因数少，而与对照组相比差异表达的基因明显增加。补骨脂素组相对对照组mRNA下调305个(FC<0.5)，上调355个(FC>2)，共21 712个。配伍组相对对照组mRNA下调415个，上调432个，共21 800个。配伍组相对补骨脂素组mRNA下调60个，上调59个，共21 675个。

3.4.2 KEGG和GO富集分析 KEGG富集见图8，补骨脂素组相比对照组，上调组中药物代谢、谷胱甘肽代谢、化学致癌性通路值得关注。GO富集分析中，上调组中静脉曲张通路值得关注，下调组中免疫与炎症相关的通路值得关注。本组出现明显的因加药导致的应激反应，如药物代谢(Drug metabolism-other enzymes, Drug metabolism-cytochrome P450)相关通路的上调，可以加速体内药物的代谢速度；谷胱甘肽代谢通路(Glutathione metabolism)上调，谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团易与某些药物、毒素等结合，使其具有整合解毒作用；化学致癌特征(Chemical carcinogenesis)，致癌物通过多种基因毒性和非基因毒性机制发挥作用。这些基因毒性和非基因毒性机制可以改变信号转导途径，最终导致过度突变、基因组不稳定、增殖控制丧失和对细胞凋亡的抵抗。在免疫与炎症方面也受到了异常抑制，并且加药导致的分解的化学反应和途径也出现了异常。

A.对照组、补骨脂素组和配伍组RNA-seq表达量主成分分析图；B.对照组、补骨脂素组和配伍组表达量(FPKM)分布的小提琴图；C.对照组、补骨脂素组和配伍组相关性热图；D.对照组、补骨脂素组和配伍组各基因FPKM密度分布图；E.对照组、补骨脂素组和配伍组的表达量箱线图；F.对照组、补骨脂素组和配伍组的归一化后的聚类热图；G.补骨脂素组和对照组表达比较的火山图红点为上调基因(FC>2)，蓝点为下调基因(FC<0.5)，灰点为无差异基因(0.5

配伍组相比对照组，KEGG(图8)中上调组中药物代谢通路值得关注,下调组中肿瘤坏死因子、慢性粒细胞白血病、甲状腺癌通路值得关注。GO中下调组中免疫调节、急性炎症反应相关的通路值得关注。本组出现明显的因加药导致的应激反应，如药物代谢相关通路的上调，可以加速体内药物的代谢速度；诱导细胞凋亡、细胞存活、炎症和免疫的信号通路下调；慢性髓系白血病的信号通路下调；甲状腺癌的信号通路下调。在细胞或有机体的保护过程、调节炎症、体液免疫反应的频率、速率或程度的过程出现异常；并且加药导致的分解的化学反应和途径亦出现了异常。

配伍组相比补骨脂素组，KEGG(图8)中上调组中前列腺癌、神经营养因子通路、长寿调节通路、HIF-1通路值得关注，下调组中cAMP通路、化学致癌性通路值得关注。GO中无重要关注的富集。本组同样出现了因加药导致的应激反应，如药物代谢相关通路的上调，可以加速体内药物的代谢速度；血小板激活通路的上调，在破坏血管壁完整性的止血中起着关键和有益的作用；神经营养因子通路的上调，神经营养因子是参与神经细胞分化和存活的营养因子家族；长寿调节通路的上调，长寿的调节取决于遗传和环境因素；转录因子-缺氧诱导因子1上调，对氧稳态起重要的调节和稳定作用；化学致癌特征明显下调。

3.4.3 差异基因的选择 基于3组比较的差异基因集的韦恩图如图9所示，补骨脂素组与对照组有差异的基因集(蓝色)中，配伍组与对照无差异(绿色以外)的基因涉及杜仲可能的解毒机制，即蓝色区24个基因和蓝色、黄色交界的4个基因。其中涉及毒性的基因gpx1b、pgd、rrm2、gstp2、anpepb、cyp1a、prf1.5值得研究。另外处于韦恩图中心，3组比较均有差异的基因且涉及毒性的nfκb2(在多种细胞类型中表达，并充当涉及炎症和免疫功能的基因的中央激活剂)同样也值得研究。

图8 各组上调与下调基因的KEGG富集分析

图9 各组差异基因的选择

4 讨论

斑马鱼与人类基因同源性达87%，其生殖周期短，繁殖能力强，胚胎在母体外发育从合子期到孵化期仅72 h，且通体透明便于实时靶器官观察。因此，选择斑马鱼用于补骨脂的毒性评价及其配伍研究，实验周期短、成本低，结果可比性强，为中药毒性和减毒配伍研究提供了良好的工具。

课题组前期研究发现补骨脂安全性受复杂多成分以及成分含量差异变化影响，导致安全性结果差异较大，本文采用具有优势的斑马鱼毒性模型快速评价了不同药味提取液、不同药味提取液与补骨脂中毒性明确的有效成分补骨脂素配伍后的毒性差异，避免了因药材批次、产地、不同提取方法等原因导致成分变化而引起的结果差异。斑马鱼毒性评价结果表明杜仲、桑寄生、女贞子提取液自身对斑马鱼影响较小，分别与补骨脂素配伍后，可明显改善鱼脏器变形，降低死亡率，有显著减毒效果，其中以杜仲结果最优。进一步对杜仲中活性成分桃叶珊瑚苷与补骨脂素配伍进行研究。

对于RNA-Seq富集结果，当补骨脂素与对照组进行比较时，从转录组测序所获得的结果有支持毒性、疾病(癌症)、炎症、免疫激活、药物代谢等方面的负面影响。而加入桃叶珊瑚苷配伍后与原有的单一补骨脂素组相比，不仅在毒性、疾病(癌症)、免疫激活方面有明显的减少，并在神经营养因子、长寿调节、血小板激活信号通路方面有明显的增强，同时，化学致癌特征信号通路出现了下降。这说明配伍可以起到一定的减毒效果，虽然如此，基于转录组分析的减毒具体机制仍然需要进行后续验证。但RNA-Seq大致指明了杜仲配伍补骨脂后减毒机制的研究方向，后续可以对长寿调节通路、HIF-1通路、化学致癌通路、谷胱甘肽代谢通路进一步探讨验证杜仲配伍后的减毒机制，并对筛选的基因转录后的mRNA进行qPCR验证，以及相关蛋白进行检测以进一步阐明解毒机制。

有效组分配伍不仅有传统配伍整体观,且存在有效组分明确的优势,其“配伍艺术”与“精准药物”相结合的巨大潜力,必将成为中医药现代化研究的关键点、突破点。注重加强对中药有效组分的配伍减毒的研究,对临床遣药组方，降低临床毒副作用，提高用药安全性有重要的指导意义。本文后续将对其配伍减毒的相关机制开展进一步的研究。