基于网络药理学的扶土生金康复方调节新型冠状病毒肺炎恢复期免疫功能机制研究

王博寒，史锁芳，张晓娜

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)恢复期患者实验室检查细胞分型表现为T淋巴细胞(CD4、CD8)比例减少为主[1]，提示恢复期患者机体仍处于免疫功能低下的状态。因此调节免疫功能是COVID-19患者恢复期治疗的关键环节。本团队前期观察了扶土生金康复方对COVID-19恢复期(肺脾不足证)患者的临床疗效，研究共纳入120例患者，其中，治疗组89例患者服用扶土生金康复方2周后症状明显好转，总有效率达94.38%，且CD3、CD4、CD8百分比较治疗前明显升高，说明该方能够有效改善COVID-19恢复期患者的临床症状和免疫功能[2]。深入研究扶土生金康复方调节机体免疫功能的多靶点、多通路作用机制，对于研发适宜于COVID-19恢复期患者的有效新型中药制剂具有重要的现实意义。本研究运用网络药理学的研究方法，探究扶土生金康复方调节免疫功能的作用靶点及相关通路，为其调节免疫功能的临床应用提供重要理论依据。

1 材料与方法

1.1 扶土生金康复方来源和组成

史锁芳教授在传承国医大师周仲瑛教授治疫经验，同时结合武汉一线抗疫实践的基础上，以扶土生金为主，兼顾疏肝解郁宁心创制了扶土生金康复方，由党参、黄芪、白术、法半夏、陈皮、茯苓、山药、核桃仁、旋覆花、香附、合欢皮、茜草、谷芽、炙甘草等组成。

1.2 扶土生金康复方的化学成分及其对应靶点挖掘

利用中医药网络药理学智能信息平台(http://www.tcmn.cn)[3]，以扶土生金康复方中的中药植物拉丁名和靶基因的Official symbol为关键词提取中药成分与活性成分相关的潜在靶点。

1.3 免疫抑制相关靶点挖掘

以“immunosuppression”为关键词在GeneCards(https://www.genecards.org/)检索免疫抑制的相关靶点，相关度的排名能够反应靶点与免疫抑制相关性的大小，筛选Relevance score≥5的靶点进行以下研究。

1.4 扶土生金康复方与免疫抑制交集靶点及功效成分筛选

将在中医药网络药理学智能信息平台中获得的药物成分靶点与在GeneCards数据库中获得的免疫抑制相关靶点进行对应，获得扶土生金康复方与免疫抑制交集靶点。将交集靶点通过Uniprot数据库，规范为人源(Homosapiens)的标准基因，作为靶点标准化的名称。

1.5 成分-靶点网络构建及分析

采用Cytoscape3.7.2软件构建“中药-成分-作用靶点-疾病”网络图并进行网络分析。利用String(https://string-db.org)数据库整合扶土生金康复方与免疫抑制交集靶点的相互作用关系，构建蛋白互作(PPI)网络。

1.6 GO富集分析和KEGG富集分析

运用R软件“clusterProfiler”软件包对活性成分和疾病的共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，设置P<0.05，得到相应柱状图和通路图。

2 结果

2.1 药物与免疫抑制共有靶点的映射

获得扶土生金康复方的靶点共1 140个，将其与免疫抑制的相关靶点461个进行映射取交集，获得扶土生金康复方治疗免疫抑制的潜在靶点118个。

2.2 扶土生金康复方中药-成分-作用靶点-疾病网络图

应用Cytoscape3.7.2软件，将中药-成分-作用靶点-疾病数据进行导入，制作网络图，见图1。图中共包括1 468个节点(14味中药、1 334个成分、118个靶点、1个复方节点和1个疾病靶点)，其中蓝色菱形代表靶点，绿色椭圆形代表中药和成分，紫红色长方形代表疾病，黄色六边形代表复方。Degree值排名前5位的成分是：槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、异鼠李素(isorhamnetin)。Degree值排名前5的靶点是：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Toll样受体2(TLR2)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管紧张素转换酶(ACE)、过氧化氢酶(CAT)。

2.3 关键靶点互作图

将前述118个共同靶点导入String平台，进行PPI网络构建，网络节点代表靶点，每个节点之间的线条代表靶点间相互作用关系，线条多少代表靶点间相互关联的强度(Degree)，不同颜色的网络节点反映作用的不同证据类型，Degree值越大，说明靶点相互作用越突出，将Degree值前30的靶点制作关键靶点柱状图，见图2～3。PPI网络发现排名前5的白蛋白(ALB)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤蛋白p53(TP53)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK3)为扶土生金康复方调节免疫功能的关键靶点。

图2 药物-疾病交集靶点互作图

图3 前30靶点柱状图

2.4 GO功能富集分析

运用R软件“clusterProfiler”对扶土生金康复方与免疫抑制的共同靶点进行GO富集分析，得到了气泡图(图4) 。气泡图横坐标表示基因百分比，圆圈越大富集数目越高，颜色越红显著性越明显。其中生物过程(BP)相关条目1 891个，富集最显著的为T细胞活化，细菌来源分子反应，氧化应激反应，蛋白质分泌的调节等。分子功能(MF)相关条目126个，富集最显著的为蛋白结合，酰胺结合，硫化合物结合等。细胞组成(CC)相关条目79个，富集最显著的为细胞外区域部分、膜封闭腔、分泌颗粒内腔、质膜的外侧面等。

图4 GO功能富集分析

2.5 KEGG富集结果分析

进行KEGG通路富集分析后得到信号通路142条，按照显著性程度P值由小到大选取前20条通路，根据结果可看出扶土生金康复方在治疗免疫抑制的靶点主要集中在PI3K-Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路等(图5)，最显著的是PI3K-Akt信号通路(图6)，其中在我们的调控网络中出现的靶点用红色方块标明。

图5 相关通路KEGG富集分析

图6 PI3K-Akt信号通路图

3 讨论

COVID-19是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道传染病，目前已累计造成世界范围内6 000余万人次感染。纵然国内疫情已经基本控制，但感染SARS-CoV-2后的危害与可能的后遗症不容忽视。SARS-CoV-2感染的突出表现是以炎症因子风暴和淋巴细胞减少为特征的宿主免疫紊乱[4]。免疫紊乱包括病毒感染后期的免疫抑制阶段，其特征是COVID-19患者出现外周血淋巴细胞计数减少，尤其表现为CD4、CD8 T淋巴细胞持续性且显著性降低[5]。同时大量糖皮质激素的应用也会出现免疫抑制的情况，甚至患者会出现急性免疫功能缺陷，增加了病毒清除延迟和再次感染的风险[6]。迄今为止，临床上尚无调节COVID-19免疫功能的特效药物，因此，寻求有效的COVID-19恢复期促康复中药具有重要的现实意义。团队史锁芳教授前期深入武汉一线抗疫，临床研究发现，COVID-19恢复期患者CD3、CD4、CD8百分比在无药物干预的情况下大多处于较低水平，提示该类患者出院后仍处于免疫低下状态。针对COVID-19恢复期肺脾不足证患者，给予扶土生金康复方治疗取得较好的临床疗效，且能调节患者的免疫功能。全方紧扣恢复期患者肺脾不足，兼有肝气郁结，心神失宁的病机特点，以党参、黄芪益气健脾，扶土生金为君药，以白术、山药、核桃仁健脾燥湿，益肾纳气为臣药；半夏、陈皮、茯苓、谷芽健脾化痰，理气开胃，合欢皮、香附、旋覆花、茜草疏肝解郁，宁心安神，活血和络，共为佐药，使以炙甘草取调和诸药，全方补益肺脾，取培土生金之意，土能生金，金得土助，则生化无穷，另外，配伍解郁宁心和络之品也是本方独特之处[2]。

本研究基于网络药理学研究扶土生金康复方调节COVID-19恢复期肺脾不足证患者免疫功能的机制，揭示该康复方中作用于免疫抑制的关键化学成分主要为槲皮素、木犀草素等，分别来自于本方的君药黄芪和党参。槲皮素是一种具有多种生物活性的天然黄酮类化合物，具有调节免疫的作用。王福生院士等研究发现COVID-19患者外周血Th17的增加和CD8 T淋巴细胞的高细胞毒性是导致免疫损伤的主要机制[7]。相关实验研究表明槲皮素能够促进T淋巴细胞亚群分化，抑制病理性CD4 T淋巴细胞[8]，对免疫细胞具有双相调节作用[9]。张桐茂等研究表明槲皮素通过调控Th17和Treg细胞的平衡对大鼠肺部免疫功能起到调节作用[10]。木犀草素在自然界中分布广泛，多以糖苷的形式存在于多种植物中。周亮等研究表明木犀草素能够提高肺癌大鼠血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，促进免疫器官的发育和分化，提高机体免疫功能[11]。综上提示，扶土生金康复方中的槲皮素和木犀草素对COVID-19免疫损伤能够起到调节作用。

扶土生金康复方药物-成分-作用靶点-疾病网络图中Degree值排名靠前的靶点是：mTOR、TLR2、TNF等。提示这些靶点是扶土生金康复方调节免疫抑制的关键靶点。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，通过调节细胞生长、增殖与代谢等发挥免疫稳态调节作用[12-13]。mTOR参与初始CD4+T细胞的分化，表现为激活STAT4和T-bet途径促进Th1细胞分化，激活STAT6和GATA3途径促进Th2细胞分化，激活STAT3和RORγt途径促进Th17细胞分化[14]。Toll样受体(TLR)是一种病原相关分子模式受体，可调控多种细胞因子的表达及Th1与Th2细胞的免疫平衡等,参与机体的炎症反应及免疫应答过程[15]。TLR2主要分布于树突状细胞等抗原提呈细胞表面。TLR2通过与TLR1或TLR6形成异源二聚体识别微生物中的脂肽、脂蛋白等结构[16]，随后胞内TIR结构域募集Myd88，激活下游信号分子IRAKs、TRAF6、IκKs，进而激活NF-κB，诱导多种细胞因子，如IL-6、TNF-α的生成[17]，故激活TLR2可以快速启动固有免疫，同时调控体内获得性免疫应答。通过String平台构建的靶点互作图看出，ALB、TNF、AKT1等为关键靶点。TNF是一种调节细胞因子，可直接作用于T细胞、B细胞及自然杀伤细胞等效应细胞，促进T细胞MHC-Ⅰ类抗原表达，增强依赖IL-2的胸腺细胞、T细胞的增殖能力，促进IL-2、巨噬细胞集落刺激因子等淋巴因子产生[18]，能够在免疫系统中发挥作用，组织免疫细胞之间的交流[19]。

KEGG富集分析显示，TLR4、TLR2、AKT、JAK、TP53、ERK、MTOR等多个蛋白靶点主要富集在PI3K-Akt信号通路上，PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，是由调节亚基和催化亚基组成的异源二聚体，Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为PI3K信号通路中极为重要的下游效应分子[20]，它能调控各种不同细胞功能，包括代谢、生长、增殖、存活、转录以及蛋白质合成等[21]。初始CD4细胞在不同细胞因子作用下可分化为功能不同的辅助性T细胞(Th细胞)和调节性T细胞(Treg细胞)，其中Th细胞又分为Th1、Th2及Th17等亚群，这些细胞亚群通过细胞因子的分泌相互影响，相互制约，形成一个CD4+T淋巴细胞的免疫调节网络，在炎症性疾病中发挥重要作用[22-23]。

综上，本研究运用网络药理学揭示了扶土生金康复方在COVID-19恢复期患者治疗中多成分、多靶点、多通路的调控特点，提示本方中槲皮素、木犀草素、柚皮素等活性成分通过T细胞活化、氧化应激等参与体内生物过程以及调控PI3K-Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路等方式调节免疫功能，为扶土生金康复方治疗COVID-19恢复期的作用机制研究提供了有益线索。有关本方中君、臣、佐、使各药调节免疫功能作用强度差别尚需进一步深入研究。