复合菌固态发酵对杂粕营养价值的影响

2021-02-22彭忠利高彦华吴华卓

中国饲料 2021年3期

涂瑞，曾钰，彭忠利，高彦华，吴华卓，柏雪

（西南民族大学畜牧兽医学院，青藏高原动物遗传资源保护与利用重点实验室，四川成都610041）

目前，我国饲用蛋白质资源严重短缺（刘长松等，2015），而菜籽粕和棉籽粕产量高、价格低廉，而且蛋白质含量均在35%以上（余勃等，2009），是潜力较大的蛋白质饲料资源。但菜籽粕和棉籽粕中含有硫葡萄糖甙、单宁、游离棉酚、植酸等抗营养因子（Khattab 等，2010），且蛋白质分子较大（Aider 等，2011），纤维物质含量较高，不仅影响其作为饲料原料的安全性、适口性和营养价值，还极大地限制了在动物生产中的应用。发酵饲料的兴起和发酵工艺的完善为该问题提供了解决思路。国内外主要采用物理法、化学脱毒和微生物发酵等方法降低棉籽粕和菜籽粕中的抗营养因子（Yang 等，2001），物理法和化学脱毒因效果单一、成本高而难以推广应用，而微生物发酵法不仅安全、脱毒率高，而且成本低、工艺简单。微生物发酵不仅能降低抗营养因子和霉菌毒素的含量，还能提高其营养价值，将植物蛋白转化为菌体蛋白，降低肽链长度，平衡氨基酸的组成（付敏等，2013），改善适口性，提高消化酶活性，调节胃肠道微生态平衡，提高消化利用率，降低生产成本，对缓解我国蛋白饲料匮乏和促进畜牧业的长远发展具有重要意义（吴正可等，2018；Liu 等，2008）。

近年来，研究者利用单一菌种对棉籽粕或菜籽粕固态发酵做了大量的研究，发现单一菌种对其营养价值的改善效果不明显，且不便在实际生产中推广应用。而复合菌固态发酵能产生更多的酶，达到单一菌种所不具备的协同效果与互补作用（Madeira 等，2012）。研究发现，黑曲霉能产生多种酶，是重要的工业酶制剂生产菌种，不仅酶的产量、活性较高，而且生长旺盛、发酵周期短，是美国FAD 认证的安全菌种（Gamarra 等，2010；Schuster等，2002）；米曲霉能有效地将淀粉、纤维素降解为易被利用的单糖等物质，合成菌体蛋白，但米曲霉只产生外切水解肽酶，对于蛋白质的利用有限（高晓梅等，2014）；而枯草芽孢杆菌能够产生活性较强的蛋白质内切肽酶、α-淀粉酶和脂肪酶（刘晓艳等，2018），同时还能分泌降解饲料中复杂碳水化合物的酶，不仅能够提高饲料中氨基酸含量，还能弥补其他菌种的不足（张玉诚等，2016）。目前利用黑曲霉、米曲霉和枯草芽孢杆菌进行混合固态发酵的研究鲜有报道。鉴于此，本试验以棉籽粕和菜籽粕为原料，利用复合菌进行固态发酵，探讨固态发酵对杂粕营养价值和安全性的影响，为优质蛋白质饲料的研发及棉籽粕和菜籽粕的合理利用提供实用技术和基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料发酵底物：棉籽粕、菜籽粕，由四川新通达生物饲料科技有限公司提供。

发酵菌种：复合菌种由黑曲霉（CICC2139AS3.324，1.10×1010～ 1.15×1010cfu/g）、米曲霉（CICC2329 沪酿 3.042，1.10×1010～ 1.14×1010cfu/g，）、枯草芽孢杆菌（BNCC188080，1.90×1010～2.10×1010cfu/g）组成。黑曲霉、米曲霉由济宁玉园生物科技有限公司提供；枯草芽孢杆菌由北京北纳创联生物技术研究院提供。

1.2 试验设计在特定条件下通过复合菌种对杂粕进行固态发酵，采用多点取样法分别采集发酵前后的样品，以相同的方法测定营养成分、抗营养因子、氨基酸含量、霉菌毒素含量和酶活性，对发酵杂粕的营养价值和生物安全进行评定。

1.3 发酵方法及条件参考本课题组前期优化的试验条件，在四川新通达生物饲料科技有限公司进行发酵，发酵混合物按以下条件混合：棉籽粕:菜籽粕=1:1；料水比=1:1；黑曲霉:米曲霉:枯草芽孢杆菌=5:5:2；接种量：5.92×107～ 6.26×107cfu/g。

将发酵混合物混合均匀后平铺在恒温发酵床（专利申请号：CN201920581366.0 已授权）中，（35±2）℃静置发酵 4 d，每天翻料一次。

1.4 样品的采集与测定

1.4.1 样品的采集将发酵底物混合均匀后，置于发酵床上，随机选择10 个点采集混合样，迅速带回实验室，65 ℃烘干，粉碎过40 目筛，保存待测。在发酵结束后，在每个发酵床随机选择10 个点采集发酵样品，低温保存迅速带回实验室，65 ℃烘干，粉碎过40 目筛，封装标号用于常规营养成分和霉菌毒素的测定。

1.4.2 常规营养成分的测定干物质、粗蛋白质、粗灰分、钙和磷的含量参照张丽英（2003）的方法测定，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量参照Van Soest 等（1991）采用滤袋法进行测定；总能采用德国IKA 等温氧弹量热仪（C6000）测定。

1.4.3 氨基酸含量的测定氨基酸含量参照《饲料中含硫氨基酸的测定离子交换色谱法》（GB/T 15399-2018）中氧化水解法测定。

1.4.4 霉菌毒素含量的测定黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量分别参照《饲料中黄曲霉毒素B1 的测定酶联免疫吸附法》（GB/T 17480-2008）、《饲料中玉米赤霉烯酮的测定》（GB/T 19540-2004）、《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB/T 5009.111-2016）中的方法测定。

1.4.5 抗营养因子含量的测定游离棉酚、单宁、植酸含量分别参照《饲料中游离棉酚的测定方法》（GB/T 13086-1991）、《饲料中单宁的测定分光光度法》（GB/T 27985-2011）、《食品安全国家标准食品中植酸的测定》（GB 5009.153-2016）中的方法测定。

1.4.6 酶活性的测定蛋白酶活性参照《蛋白酶活力测定法》（SB/T 10317 ～ 1999）中福林酚法进行测定；α-淀粉酶活性和脂肪酶活性分别采用南京建成生物工程研究所的α-淀粉酶试剂盒和脂肪酶试剂盒测定，按说明书操作进行测定，操作室室内温度在20 ℃左右。

1.5 数据统计分析原始数据经Excel 2016 初步整理后，调用SPSS 24.0 软件中成对样本t 检验来完成配对样本平均数的差异显著性检验，结果以 “平均值±标准差” 表示，P ＜0.05 表示差异显著，P ＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 复合菌固态发酵对杂粕营养组成的影响由表1 可知，与发酵前相比，发酵后干物质含量无显著变化（P ＞ 0.05）；发酵后粗蛋白质、粗灰分、钙、磷含量分别显著提高了15.19%、11.67%、18.18%、22.43%，中性洗涤纤维含量显著降低了15.47%；酸性洗涤纤维含量和总能无显著变化（P ＞0.05）。

2.2 复合菌固态发酵对杂粕氨基酸含量的影响由表2 可知，与发酵前相比，发酵后除谷氨酸外（P ＞ 0.05），总氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸及其他种类的氨基酸含量均显著提高（P ＜0.05），其中赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和总必需氨基酸含量分别提高了30.93%、23.97%、22.07%、20.56%和21.36%，胱氨酸有显著提高的趋势（P =0.053），精氨酸含量降低，但差异不显著（P ＞ 0.05）。

表1 固态发酵杂粕营养成分的变化（干物质基础）

表2 固态发酵杂粕氨基酸含量的变化（干物质基础） %

2.3 复合菌固态发酵对杂粕霉菌毒素和抗营养因子含量的影响由表3 可知，与发酵前相比，发酵后黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量分别降低了 21.25%和 28.56%（P ＜ 0.001），而脱氧雪腐镰刀菌烯醇在发酵后未检出。与发酵前相比，发酵后游离棉酚、单宁和植酸的含量分别降低了51.51%、21.21%和 23.22%（P ＜ 0.05）。

表3 固态发酵对杂粕霉菌毒素和抗营养因子含量的影响

2.4 复合菌固态发酵对杂粕酶活性的影响由表4 可知，与发酵前相比，发酵后蛋白酶活性显著提高了 115.21%（P ＜ 0.001），脂肪酶活性有显著提高的趋势（P =0.083），而淀粉酶活性无显著变化（P ＞ 0.05）。

表4 固态发酵对杂粕酶活性的影响

3 讨论

3.1 复合菌固态发酵对杂粕营养组成的影响微生物发酵是改善棉籽粕和菜籽粕营养价值的有效途径之一。吴正可等（2018）利用筛选出的嗜酸乳杆菌与酿酒酵母、枯草芽孢杆菌对菜籽粕进行混菌发酵，发酵后菜籽粕呈黄褐色蓬松状，粗蛋白质含量提高了18.30%。孙林等（2017）研究发现，菜籽粕经混菌发酵后粗蛋白质的含量由36.20%提升到42.50%，显著提高了多肽的含量，降低了植酸和单宁的含量。 Sun 等（2012）通过添加枯草芽孢杆菌和木瓜蛋白酶发酵棉籽粕，结果表明发酵显著提高了粗蛋白质和粗灰分的含量，显著降低了粗脂肪和粗纤维的含量。本试验结果表明，发酵4 d 后粗蛋白质由43.06%提升至49.60%，提高了15.19%，与豆粕的蛋白水平相当，中性洗涤纤维含量降低了15.47%，与上述研究结果一致。可能是发酵过程中微生物将杂粕中的粗蛋白质转化为动物更易利用的菌体蛋白等物质，同时也消耗了碳水化合物，造成发酵杂粕中干物质的损失，出现了蛋白质的“浓缩效应”（吴正可等，2018），最终导致发酵杂粕粗蛋白质含量的升高。发酵后发酵杂粕的粗灰分提高了11.67%，可能是发酵过程中微生物利用了杂粕中的有机物，使得粗灰分的相对含量升高，与Chi 等（2016）的研究结果一致。从形态学观察，杂粕经过4 d 的发酵后，表面由光滑变得疏松多孔，且散发着浓郁的香味。可能是微生物分泌的酶对纤维结构造成破坏，这也是发酵后纤维物质含量降低的重要原因之一，而疏松多孔的结构也增加了消化酶的接触面积（Gilani 等，2005），使得杂粕发酵效果更好，更有利于动物的消化吸收（付敏等，2013）。

研究表明，黑曲霉和枯草芽孢杆菌都具有良好的产植酸酶能力，通过植酸酶水解植酸，将其中的植酸磷释放出来供动物吸收，不仅能降低植酸的抗营养作用，还能减少无机磷的添加。本试验中杂粕发酵后磷含量提高了22.43%，而植酸的含量降低了23.22%，与鲍振国（2013）利用枯草芽孢杆菌对棉籽粕进行固态发酵，总磷含量显著提高，植酸含量显著降低的结果一致。樊春光（2013）通过复合菌对豆粕进行固态发酵，结果发现钙含量由0.32%提升至0.37%，总磷含量由0.62%提升至0.68%，本试验中发酵杂粕的钙磷含量分别为0.39%和1.31%，钙含量与发酵豆粕相当，而总磷含量约为发酵豆粕的两倍。因此发酵杂粕对日粮中钙磷的缺乏起到了很好的补充作用，可减少无机磷的添加，降低生产成本，同时发酵过程中产生的酶系及多肽类物质还会促进机体对钙磷的吸收（顾斌等，2011）。

3.2 复合菌固态发酵对杂粕氨基酸组成的影响微生物发酵可将不易被机体吸收的大分子物质降解为小分子肽、游离氨基酸和低聚糖等，此外发酵底物中留存有大量消化酶、维生素、氨基酸和未知促生长因子，从而改善杂粕的营养价值和饲用价值（Dai 等，2017）。付敏等（2013）利用枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白地霉对菜籽饼进行固态发酵，结果表明，随着发酵时间的延长，游离氨基酸呈线性增加，赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量分别提高了22.73%、20.39%和 20.51%。王晓玲等（2016）利用枯草芽孢杆菌ST ～141 和酿酒酵母N5 对棉籽粕进行混菌固态发酵，48 h 后氨基酸总量和必需氨基酸含量分别增加了22.20%和28.40%。张梦媛等（2019）研究发现，毛霉与鲁氏酵母发酵豆粕后，游离氨基酸含量增加了6.69 倍，总氨基酸含量提高了22.90%，提高了豆粕的营养价值。本试验中，杂粕经复合菌固态发酵后，除谷氨酸和精氨酸外，其余氨基酸、总氨基酸、总必需氨基酸含量均不同程度地升高，与前人研究结果一致。说明杂粕经过复合菌固态发酵后，氨基酸组成的含量更高，组成更合理，更有利于在实际生产中推广应用。

3.3 复合菌固态发酵对杂粕霉菌毒素和抗营养因子含量的影响吴正可等（2018）发现，混菌固态发酵能有效地降低菜籽粕中硫苷的含量，降解率可达30.73%；胡永娜等（2012）通过枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和啤酒酵母三种菌组合对菜籽粕进行发酵，硫代葡萄糖甙、恶唑烷硫酮、单宁、植酸降解率分别为93.44%、99.99%、34.86%、18.15%。王晓玲等（2016）利用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母对棉籽粕进行固态发酵，48 h 后游离棉酚的降解率为48.5%。本试验中，发酵杂粕中游离棉酚、单宁和植酸的含量分别降低了51.51%、21.21%和23.22%，与上述研究结果基本一致。表明复合菌固态发酵能有效降低杂粕中的抗营养因子，对杂粕的营养水平和适口性具有一定的改善作用。

在实际生产中，饲料厂和大型养殖场在饲料原料收集和发酵等方面都是处于开放环境，对发酵条件并没有严格控制，除了所挑选的菌种，环境中的能产生霉菌毒素的菌株也可能参与了发酵过程，威胁生物安全。金佳佳等（2019）以香豆素作为唯一氮源，从豆类发酵食品、土壤、动物肠道及其内容物中筛选出一株具有黄曲霉毒素B1降解能力的菌株，降解率可达90.70%。刘盼等（2018）从土壤中筛选出一株具有高效降解玉米赤霉烯酮的枯草芽孢杆菌（L09），经过24 h 发酵后上清液对玉米赤霉烯酮的降解率达到了96%。吴娱等（2016）研究发现，不同初始质量浓度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经米曲霉 As-W.6 发酵7 d 后，降解率均在35%以上。本试验测定三种常见饲料源霉菌毒素在发酵前后的变化，发现黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量降低了21.25%和28.56%，而脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量低于检出限（0.2 mg/kg）。《饲料卫生标准》（GB 13078-2017）中对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇给出的限量分别是 30.00 、1000 μg/kg 和 5.00 mg/kg，杂粕发酵前后霉菌毒素的含量均低于饲料卫生标准。由于本试验选取的杂粕（棉籽粕和菜籽粕）中所含有的霉菌毒素的含量相对较低，发酵后相应的降解率也较低，但通过复合菌固态发酵对降低以上三种霉菌毒素仍有显著效果，可进一步保障饲料安全。

3.4 复合菌固态发酵对杂粕酶活性的影响微生物在生长和发酵的过程中会分泌大量的酶类，可降解底物中的蛋白质、纤维等大分子物质，使之更容易被动物吸收利用（张梦媛等，2019）。和小黑（2014）研究发现，发酵棉籽粕中含有丰富的淀粉酶和蛋白酶。本试验中，发酵杂粕中蛋白酶和脂肪酶分别提高了115.21%和8.47%，脂肪酶虽有一定的提高，但差异不显著。这与廖天江（2018）利用黑曲霉对沙棘籽渣进行固态发酵，其终产物蛋白酶活性提高705.95%的结果基本一致。刘慧菊等（2019）研究发现，枯草芽孢杆菌、黑曲霉、植物乳杆菌均能产生一定量的蛋白酶，其酶活力大小依次为：枯草芽孢杆菌＜黑曲霉＜植物乳杆菌。