高粱蜀黍苷的研究进展

(吴 荣 牛江帅 岩温香 程欣然牛庭莉 杜吉到 戴凌燕

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院1，大庆 230000)

(黑龙江八一农垦大学农学院2，大庆 230000)

高粱(禾本科)是一种耐旱谷物，即使在严重干旱胁迫下也能保持生长，由于其高度适应性，是半干旱地区重要的谷物和牧草作物[1，2]；是世界第五大主要谷类作物，就营养成分和能量价值而言，高粱可以作为玉米的替代作物，用于人类食物和牲畜饲料以及其他用途[1]。

高粱含有蜀黍苷( dhurrin) ，是一种生氰糖苷。蜀黍苷由L-酪氨酸经三种生物合成酶(两种细胞色素P450，CYP79A1和CYP71E1酶以及UDP-糖基转移酶，UGT85B1) 的作用衍生而来，编码这3种酶的基因形成1个生物合成基因簇，在高粱基因组中彼此相邻；还有1个转运蛋白(multidrug and toxic compound extrusion，MATE) ，其作用是将潜在的自毒化合物隔离在植物细胞液泡中[3]。CYP79A1催化2个连续的N-羟基化反应，然后进行脱水和脱羧反应，在该反应中酪氨酸转化为对羟基苯基-乙醛肟，然后将肟通过CYP71E1转化为糖苷配基对羟基扁桃腈，随后由可溶性UDPG-糖基转移酶作用，生成蜀黍苷[4-7]。由于蜀黍苷生物合成涉及两种膜锚定的细胞色素P450酶，因此发生在内质网( ER) 的胞质表面，由于苯环上羟基的电离而在非酸性环境中不稳定，它稳定地储存在酸性液泡隔室中，但其从内质网向液泡的细胞内转运机制尚不清楚[8]。蜀黍苷在高粱种子中没有或较少，植株地上部的蜀黍苷含量比地下部高，叶片比茎高，且幼苗第一叶含量最高，叶片近轴端比远轴端高；在种子整个发芽期基本保持不变，发芽种子和未发芽种子蜀黍苷含量几乎没差别，发芽后地上部、根部、整株幼苗蜀黍苷含量明显增加[9-12]。不同酒厂酿酒高粱中都检测到蜀黍苷，平均含量在4.52～19.82 mg/kg，其中粳高粱中蜀黍苷平均含量普遍高于糯高粱，且不同品种的酿酒高粱中蜀黍苷含量不同[13]。氰化物最小致死口服剂量为0.5～3.5 mg/kg，蜀黍苷本身没有毒性，生氰植物被动物取食或者病原体侵染后，蜀黍苷与组织细胞内的β-葡萄糖苷酶和α-羟晴酶接触后降解，释放氰化氢和醛类化合物，氰化物与细胞色素C氧化酶的Fe3+结合，阻断了呼吸链的最后一步，进而引起细胞中毒性缺氧症，如心律紊乱、肌肉麻痹、呼吸窘迫等[14，15]。蜀黍苷还起着氮的储存作用，可以通过循环途径进行转移，从而避免氰化氢的形成，并在特定的发育阶段提供重要的还原氮来源[16，17]。酒精饮料Burukutu的不同品牌中，氰化物的含量从3.5～9.6 mg/kg，在复合面粉面包和啤酒中没有检测到氰化物[18]。因此，全面了解生氰糖苷生物合成途径，对高粱中生氰糖苷进行风险评估，采取适当措施降低其含量具有重要的意义。

1 植物生氰糖苷的定量分析

通过液氮研磨或机械粉碎等方法处理植物样品后，再经过物理和化学方法可将生氰糖苷提取出来，然后通过色谱法或比色法进行定量测定。

1.1 样品的处理方法

常见的样品处理方法有液氮研磨法和机械粉碎法。用液氮处理时，液氮温度为-196 ℃，样品组织变硬，脆性增加从而粉碎样品；机械粉碎法是利用粉碎机对样品进行粉碎，使样品变为小块、细粉或粉末。周韩玲等[19]研究表明，与机械粉碎法相比，液氮研磨法粉碎的高粱种子样品提取液中蜀黍苷平均含量略高，但是稳定性极差，而机械粉碎法检测值比液态氮研磨法低2.0%，说明机械粉碎过程中样品的蜀黍苷水解性较差。孙红等[20]也用机械粉碎法处理亚麻籽后测定其生氰糖苷的含量。液氮研磨法取样量少，且成分不易被破坏或降解；但是研磨的样品均匀性差，细度不一致，样品在研磨、转移过程中可能有一定损耗。同液氮研磨法相比，机械粉碎法较为稳定，重复性好，操作简单、安全系数高、处理速度较快，且实验成本较低。

1.2 含量测定

1.2.1 HPLC法

用液相色谱法测定植物中生氰糖苷含量的液相色谱条件为：色谱柱C18柱(100 mm×2.0 mm，3 μm)，柱温30 ℃，流速0.2～2.0 mL/min，进样体积1.0～5.0 μL；常用的流动相有乙腈、甲酸、水[21,22]；邹良平等[23]通过HPLC测定各种木薯叶片中生氰糖苷的含量，结果表明，与国外所用木薯品种Mcol22相比，大部分木薯品种的生氰糖苷含量都较低，最低每克鲜重只有11.3 mg/kg。高效液相色谱检测生氰糖苷的含量时还可以与质谱联用。液质联用以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，样品经流动相被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。质谱检测方式有多离子反应检测(MRM)和蒸发光散射检测(ELSD)。刘锦仪等[24]用HPLC-ELSD 法检测澳洲坚果果仁、花、叶、壳、青皮各部位生氰糖苷含量，结果发现花中生氰糖苷含量最高，达(49.92±0.96) mg/kg。高效液相色谱法直接测定植物中生氰糖苷含量，精度高。但是，该方法使用的生氰糖苷标准品非常昂贵，且在市场上不常见。

1.2.2 通过测定氢化势(HCNp)计算含氰量

根据生氰糖苷可在-葡萄糖苷酶作用下生成氰化氢的原理，可以通过测定氰氢酸的含量进而间接计算出植物中生氰糖苷的含量。氰氢酸的检测方法有硝酸银滴定法和比色法。硝酸银滴定法为国家标准所用方法，它适用于测量氰氢酸含量大于1 mg/kg的样品[25]。用硝酸银标准溶液滴定氰氢酸时，硝酸银浓度通常选用0.02 mol/L，以碘化钾做指示剂，银离子先与氰氢酸根离子发生络合反应，形成可溶性络合物Ag(CN)2，到达终点时，多余的硝酸银与碘离子反应生成浑浊沉淀，指示终点，以消耗硝酸银的用量从而计算氢氰酸的含量。赵胜男[26]采用硝酸银滴定法测定了亚麻饼中生氰糖苷含量为149.17 mg/kg。比色法主要有异烟酸—吡唑啉酮比色法、吡啶—巴比妥酸比色法和苦味酸比色法。异烟酸—吡唑啉酮比色法、吡啶—巴比妥酸比色法均在中性条件下，先由样品中的氰化物与氯胺T反应生成氯化氰，然后采用不同的途径生成有色物质进行比色。在异烟酸—吡唑啉酮比色法中，氯化氰与异烟酸作用，经水解后生成戊烯二醛，最后与吡唑啉酮缩合生成蓝色染料，在638 nm波长测定吸光值[27]；在吡啶—巴比妥酸比色法中，氯化氰与吡啶反应生成戊烯二醛，戊烯二醛与两个巴比妥酸分子结合生成红紫色染料，在580 nm波长测定吸光值[28]。在苦味酸比色法中，氰氢酸在NaOH溶液中反应生成氰化钠，氰化钠再与苦味酸反应生成玫瑰红色染料，于波长538 nm处测定吸光度[29]，Gleadow等[30]用苦味酸比色法测定生氰糖苷的含量。通过氢化势间接测量生氰苷的方法简单、快速、准确且相对便宜。

2 高粱蜀黍苷的代谢调控

高粱蜀黍苷的代谢过程受多种因素调控，尽管对其精细的调控机制还没有十分的了解，但已有的研究成果为蜀黍苷的发酵工艺改进和菌种选育提供了思路和方法。蜀黍苷代谢相关酶、代谢途径周围微环境以及外源物质严格控制着蜀黍苷的代谢过程。了解高粱蜀黍苷的代谢调控，在高粱的转基因技术、脱毒、以及其他的生理功能中都起着重要作用。

2.1 相关酶的调控

细胞色素P450 CYP79A1酶是蜀黍苷生物合成的关键酶，以水稻Act1启动子为启动子，反义克隆cyp79a1基因，用基因枪法转化高粱品种CSV-15的茎段分生组织，获得转基因植株。转基因高粱植株中HCN的生化检测证实，转基因植株及其后代中的HCN水平显著降低[31]，这种方法被认为是可行和有效的，并且已经被证明可以减少木薯中的亚麻苦苷[32]。此外，这些高粱基因诱导氰苷产生的有效性已在拟南芥和烟草中得到证实[33]。反义技术可以大幅下调但不会完全阻断靶基因[34，35]，对于高粱来说，cyp79a1基因是一个候选基因，因为它是蜀黍苷生物合成途径中的第一个酶，而cyp79a1基因的下调会导致次生产物的不积累。Behrooz[36]等报告双色高粱中的氰基葡萄糖苷的基因簇还包含一个基SbMATE2，该基因编码称为SbMATE2的MATE转运蛋白和谷胱甘肽S - 转移酶( GST) 的基因，与生物合成基因共表达。SbMATE2-YFP融合蛋白的瞬时表达和共聚焦显微镜实验证明了SbMATE2在液泡膜上的定位。在非洲爪蟾卵母细胞中的转运研究表明，SbMATE2能够转运蜀黍苷和非内源氰基葡萄糖苷。与CYP79A1共表达最高的基因是CYP71E1，其次是SbMATE2，此外，sbgst1和ugt85b1基因与CYP79A1共表达，这两个基因彼此共表达水平最高。

水分限制使成年植株氰化物缺乏1类( acdc1) 突变体芽中的蜀黍苷浓度增加到与野生型植物相同的程度，并且未观察到品系之间的生长优势或劣势。充分浇水后，突变体acdc1 叶片组织中较低的蜀黍苷浓度与突变体的芽和根中硝酸盐含量的增加有关。这项研究发现植物年龄和水分限制是高粱中蜀黍苷浓度的最重要决定因素。在完全浇水的条件下，acdc1叶片组织中的蜀黍苷浓度较低，尽管水充足，随着植物的成熟，HCNp下降，但蜀黍苷合成的仍在继续，植物中总的蜀黍苷含量一直在增加直到最终收成为止[37]。Cecilia 等[38]使用针对性的基因组局部诱变( TILLING) 来鉴定具有突变的品系，该突变导致UGT85B1 N端区域提前终止密码子。该突变的纯合植物不产生蜀黍苷，命名为tcd2突变体( 完全缺乏氰化物2) 。它们的活力减弱、植株矮小、根系发育不良、生育力低下。使用LC-MS 进行分析显示，tcd2突变体积累许多从蜀黍苷途径衍生的代谢产物，其中一些与在表达cyp79a1和cyp79a1基因的拟南芥中观察到的相似。结果表明，UGT85B1对于高粱中蜀黍苷的形成至关重要。

2.2 代谢途径周围微环境的调控

蜀黍苷代谢途径周围的微环境(如脂质膜)增加了蜀黍苷前体L - 酪氨酸向蜀黍苷的转化，细胞溶质微环境已被提议用作蜀黍苷的稳定溶剂[39]。天然深共晶溶剂NADES由生物活体中常见代谢物组成，分析含有不同的NADES成分，以评估它们对生物合成酶的可能影响。在由葡萄糖：酒石酸和葡萄糖：苹果酸组成的NADES浓度为5 %的情况下，观察到膜相关代谢物最大活性，基于NADES的蜀黍苷生物合成酶在较高的温度下都表现出较高的稳定性；在60 ℃下暴露30 min后，活性保持至少50%，这表明NADES可以提供一个惰性环境，防止蛋白质不可逆变性或抑制[40]。

Tomas等[41]通过在脂质体中体外重组蜀黍苷酶，研究UGT85B1对L - 酪氨酸向蜀黍苷转化的影响，用不同比例的磷脂在脂质体中进行重组实验，考察膜脂组成对蜀黍苷途径细胞色素P450酶催化活性的影响。细胞色素CYP79A1酶活性受磷脂组成的影响较小；相反，CYP71E1酶的催化效率对脂质环境高度敏感。为研究植物中生氰糖苷途径酶的组织结构，在烟草叶表皮细胞中瞬时表达生氰糖苷途径酶以及它们的不同组合，结果证明CYP79A1和CYP71E1酶形成同质和异质低聚物，使胞质可溶性UGT85B1酶能够募集。UGT85B1调节L - 酪氨酸的通量，刺激细胞色素CYPP79A1和CYPP71E1酶之间的通道，有效的新陈代谢通量和通道需要一个整体带负电荷的脂质表面，并可能提供一种额外的手段来调节快速应对环境挑战所需的动态组装。

2.3 外源物质的调控

近年来，酿酒酵母已被证明是生产植物天然产品的有效宿主，如阿片类药物吗啡[42]、诺斯卡品[43]以及异长春花碱[44]。Kotopka等[45]通过在酵母中共表达蜀黍苷途径酶和植物细胞色素P450还原酶来产生蜀黍苷，通过过量表达特定的宿主酶来增加前体酪氨酸的供应，从而进一步提高了蜀黍苷的产量。此外，他们还以蜀黍苷产生菌为平台，研究双色葡萄球菌基因组中蜀黍苷簇附近的一些酶的功能。结果表明，蜀黍苷通过天然酵母酶的过表达而显著增加，并且拟南芥细胞色素P450还原酶能够与酵母中的双色链球菌P450酶偶联以增加蜀黍苷的产生，这项工作表明，通常与蜀黍苷生产有关的酶类可以在酵母中功能性表达。在微生物宿主中测试这些基因簇的能力，没有潜在的混淆植物酶活性，将是未来研究生氰糖苷生物合成的一个有价值的工具。

植物叶绿体是光驱动的细胞工厂，具有作为代谢工程应用底盘的巨大潜力。利用植物叶绿体，展示了光合还原力如何驱动代谢途径来合成生物活性天然产物。为此，Gnanasekaran等[46]将双色高粱的蜀黍苷途径引进烟草的叶绿体中，通过将CYP79A1、CYP71E1和UGT85B1 整合到烟草叶绿体基因组的中性位点，将整个途径引入叶绿体。两个P450s和UGT85B1在叶绿体中表达时具有功能，并直接使用来自光合电子传递链的电子驱动将内源性酪氨酸转化为蜀黍苷，而不需要存在NADPH依赖性的P450氧化还原酶，这一发现与先前的体外重组实验[47]和瞬时表达研究[48]的结果一致。所获得的结果为参与合成经济上重要的化合物的植物P450s进入叶绿体的类囊体膜铺平了道路，并证明它们的全部催化循环可以直接由光合作用产生的电子驱动。

3 高粱蜀黍苷可能的脱毒方法

在农产品中生氰糖苷的脱除常见的方法有物理化学法、生物发酵法和转基因法；但是高粱中生氰糖苷的脱除目前没有相关的研究，因此，参考其他农作物的脱除方法对指导降低高粱中蜀黍苷的含量具有重要的意义。

3.1 物理、化学法

氰苷一般味苦，易溶于水、乙醇；加热使酶失活可阻碍氰苷分解产生有毒物质氰化氢。常见的物理化学方法有水煮法、蒸煮法、烘烤法、挤压法和溶剂法。

水煮法的原理是根据生氰糖苷可溶于水的特性，随着水温连续增加，糖苷酶活性增加，生氰糖苷在糖苷酶的催化作用下溶解速率不断增加，氰化氢的沸点相对较低被释放出来，达到脱氰的效果，在80 ℃下可降低样品中90%以上的生氰糖苷[49]。蒸煮法是在高温、高压下进行的，糖苷酶活性随反应温度的升高而升高，但超过一定的温度则失活，此外，高压也能使生氰糖苷的化学结构破坏，从而起到脱毒效果，在120 ℃的高压灭菌锅内蒸煮15 min可将氰苷完全去除[50]。烘烤法相对蒸煮法而言是在130 ℃、常压干燥的条件下进行的，因此脱除效果没有蒸煮法好，可使生氰糖苷降低10%～69%[51]；挤压法是集混合、搅拌、破碎、加热、蒸煮、杀菌、膨化及成型等为一体的高新技术，它具有高温、高压、短时强烈挤压、剪切处理和热处理的功能，挤压法使样品中生氰糖苷降低90%左右[52]。溶剂浸提法是利用相似相溶的原理，用甲醇或氨水等极性化学溶剂对生氰糖苷进行萃取，该方法可降低84%～89%[53]。综上，在降低样品生氰糖苷的物理化学方法中，蒸煮法的效果最好。

3.2 生物法

生物脱毒法是指筛选出能高产β-葡萄糖苷酶的微生物，或利用现代基因工程技术人工构建具有高效降解生氰糖苷特性的工程菌，使其在自身代谢活动中大量产生β-葡萄糖苷酶，进而去除农产品中的生氰糖苷。有研究者成功分离出一些能产生β - 葡萄糖苷酶的微生物，如乳酸菌、酵母菌、霉菌等[54]。乔琳等[55]从工业废水中分离出一株能降解氰化物的细菌并探究了其最适降解条件，其粗酶液具有显著降氰能力。Wu等[56]将人肝脏β - 葡萄糖苷酶基因和细菌氰化物水合酶基因一起导入酵母菌中构建工程菌，利用该菌产生的酶制剂对亚麻籽进行脱毒处理后发现，其生氰糖苷几乎可以完全脱除。与物理和化学脱毒法相比，生物法脱毒具有作用条件温和、安全高效等优点。

由于高粱是优质酿造白酒行业的主要原料，有效去除高粱中蜀黍苷具有重要意义。目前，在高粱酿酒过程中，通过高粱种子粉碎、蒸煮糊化和发酵等环节可以达到脱除蜀黍苷的效果。

3.3 转基因法

简单的加工只能去除部分氰苷，残留部分仍可能对人体造成危害，并且加工过程对农产品品质造成一定的影响。转基因技术可实现进一步去除有毒的氰苷，减少加工带来的损失。目前，转基因研究主要对象为木薯，通过抑制cyp79d1和cyp79d2基因的表达，以抑制氰苷的合成及增加羟腈分解酶的合成，加快氰苷的分解，最终减少木薯食用部位中的氰苷含量。具体方法有通过反义RNA和RNA干扰使基因沉默，导入外源性启动子调节相关酶的合成。

4 展望

高粱含有丰富的营养成分，常用作酿酒的原料和饲料作物。高粱中的蜀黍苷是一种植物内源性毒素生氰糖苷，蜀黍苷与β -葡萄糖苷酶接触会释放有毒物质氰化氢，其存在对动物和人类造成严重危害。因此全面了解高粱中蜀黍苷的生物合成和降解途径，识别分析生氰农产品的种植、贮运、加工及摄食等环节危害及其特性，采用不同的物理化学和生物方法去除蜀黍苷残留物可以提高啤酒的品质，但是目前高粱脱毒的方法鲜有研究，后期可进一步研究有效的脱毒措施，为高粱中蜀黍苷的风险评价以及农产品质量安全监管提供参考。