基于mt DNA COI基因的新疆部分地区叶蝉的分子鉴定

张海燕，陈光辉，古丽扎尔·阿不都克力木，张秀英，王玉涛

（1喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什 844000；2新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆喀什 8440000）

0 引言

叶蝉属半翅目，角蝉总科(Membracoidea)，叶蝉科(Cicadellidea)昆虫[1]。全世界已知 43亚科、2345 属[2]，超过20000种[3]，中国24亚科[2]，约2000种[3]。叶蝉危害植物叶片、根茎部、韧皮组织造成直接损害，部分种类传播植物病毒[4]，蔡平等[5]统计，植物病毒病媒介昆虫世界范围内已知的约397种，其中叶蝉133种，将近1/3，传播86种病原物[6]。害虫种系的准确鉴定影响防治方法的有效性[7]，但部分叶蝉体型和体色易随发育阶段或生境改变[8]，如广头叶蝉Macropsinae若虫的体色、警觉性随虫龄变化[9]，也说明叶蝉在低龄期和若虫期较易防治，但若虫形态差异较小，鉴定较为困难。DNA条形码技术补充了形态鉴定法的短板，能够对不同发育历期、不同形态、残体昆虫有效鉴定，岳巧云等[10]基于COI基因成功鉴定玉米象Sitophilus zeamais幼虫。崔中翌等[11]基于CO1基因对343头果蝇Drosophila melanogaster幼虫或卵成功鉴定。Caterino等[12]利用COI和18S rDNA基因鉴定了伴阎甲亚科Histeridae的幼虫。1993年Fang[13]首次用16SrRNA基因序列法研究了角顶叶蝉Dloctephaliane的系统发育。Johnson等[14]用16SrRNA、ND1和tRNA基因分析了红额叶蝉属Errhomus几种叶蝉的种间亲缘关系。Palomera、Bluemel[15-16]利用COI基因分别研究了玉米黄翅叶蝉Dalbulusmaidis和黄条脊冠叶蝉Aphrodes leafhoppers的遗传多样性。BOLD数据库中记录了1973种叶蝉，拥有条形码的有1414种，4461条叶蝉的条形码被记录[17]。戴仁怀等[18]在2008年，基于28S rDNA D2、16S rDNA首次在国内分析研究角顶叶蝉亚科进化关系。倪俊强等[19]基于COⅡ基因分析了闽桂地区尖凹大叶蝉Bothrogonia acuminata5个地理种群的进化地位。俞鹏飞等[20]采用引物步移法研究白边大叶蝉Kolla paulula(Walker)线粒体基因组序列特征，发现白边大叶蝉属角蝉总科叶蝉科。乔利等[21]通过Cytb、COI基因，明确了信阳地区4种叶蝉种类、遗传关系。中国对于叶蝉的DNA条形码研究大多集中于对成虫的研究，对叶蝉若虫的研究较少。昆虫幼虫的形态分类是个难题[22]；COI基因进化速率快、序列保守，分子标记效果较好[23-24]。基于此，本研究首先通过形态分类，对未知叶蝉分类识别；提取叶蝉基因组，基于mt DNACOI基因，对提取的基因组用通用引物PCR扩增、测序；对目的基因序列用生物信息学软件进行相似性分析、计算种间距离、分析遗传进化地位，获得不同种类叶蝉快速鉴定的DNA条形码。南疆与多国接壤，较容易遭生物入侵，作为农业大区，植被种类多，易于叶蝉生存，但区域内叶蝉分类识别基础薄弱，研究叶蝉DNA条形码的报道更为少见。本研究选用COI基因对4种叶蝉若虫和2种成虫进行分类鉴定，可丰富边境地区叶蝉基因数据库、为维护生物安全和害虫有效防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

本研究叶蝉样本分布于新疆部分农田，用捕虫网扫捕、黄板诱捕获得（表1）。首先形态分类鉴定，初步分为6种叶蝉标本，标记为A、B、C、D、E、F，在离心管中加入99%的无水乙醇，将标本放入离心管，冷藏于4℃冰箱中，实验于2020年5—10月在新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室开展。

表1 叶蝉标本信息

1.2 仪器设备

体视显微镜(Motic Cam2506 SMZ168)、离心机(BECKMAN COULTERTM AllegraTM X-22R Centrifuge)、FM100 雪花制冰机(YKKY)、振荡器(IKA MS3 digital)、恒温水浴锅、PCR仪（Veriti TM 96-Well PCR 4375786新加坡制造）、伯乐Bio-RadPowerpacHC电泳设备、凝胶成像仪(Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR)等。

1.3 提取叶蝉DNA基因组

由于叶蝉若虫体型较小，为保证基因组提取效果，参照邹志文等Chelex100改进法提取叶蝉DNA[25]。

（1）取1只叶蝉，用双蒸水在离心管中将样本清洗数次，后将样本置于滤纸上数分钟直至干燥。

（2）将干燥的叶蝉样本放入离心管中(1.5 mL)，对玻璃棒高压灭菌后紧贴管壁充分研磨样本。

（3）吸取0.5 mL双蒸水（已灭菌），加入装有叶蝉样本的离心管中，充分涡旋溶液至均匀，放入-70℃冰箱中冷却4 min。

（4）将离心机参数设置为12000 r/min，将溶液离心5 min，缓慢抽取上清弃去，只留下沉淀，重复此步骤3次。

（5）将5%的Chelex-100溶液摇匀，抽取120 μL，加入到沉淀中，调整恒温水浴锅的温度为56℃，将溶液摇匀后加热2 h。

（6）涡旋5～10 s，将离心管封口（防止溶液喷溅）放入100℃的恒温水浴锅，加热10 min。

（7）涡旋溶液 5～10 s，将离心机参数设置为10000 r/min，将溶液离心5 min，提取离心所得上清液，在-20℃条件下保存，作为DNA模板。

1.4 基因组PCR扩增

引物由北京奥科生物公司合成，上游引物LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，下游引物 HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGAC CAAAAAATCA-3’[26-28]。使用通用引物对COI序列PCR扩增，扩增体系总体积设置为21 μL，其中2×Taq酶7.2 μL，ddH2O 12 μL，上下游引物各为0.4 μL，DNA模板1 μL。反应条件及步骤为：95℃预变性5 min，95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环40次，循环结束后72℃延伸7 min，4℃条件下保存。PCR产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.5 处理数据、构建系统进化树

将扩增的目的基因送专业测序公司测序，经测序仪生成abi文件，首先用Chromas 2.6.6软件打开测序获得的基因序列的峰图，查找误读的碱基手动校正。用DNAMAN4.0软件进行序列正反链拼接匹配校正。用NCBI数据库的BLAST程序比较序列同源性，确定所测序列属昆虫COI基因序列。下载Score较高、Query cover大于90%、Per ident高于80%的序列，用ClustalX 1.83软件比对下载序列与测序所得序列。用MEGA7.0.14统计序列碱基组成、变异位点、核苷酸组成。选用Kimura 2-Parameter模型计算种间遗传差异，用DAMBE7.2.136基于P距离分析序列碱基替换饱和性、检测系统发育信号。用NJ邻接法(Neighbour-Jioning)构建系统进化树，循环1000次，估计进化树中节点的置信度(bootstrap confidence level，BCL)。

2 结果与分析

2.1 叶蝉标本初步形态鉴定

参照表2中叶蝉成虫及若虫的形态特征及6个叶蝉样本的外部形态，初步划分样本所属类群，经分析所研究样本分属6个亚科，6种叶蝉背面、侧面、腹面形态特征见图1。

图1 6种叶蝉形态特征图

表2 6种叶蝉形态特征

续表2

2.2 序列分析

本研究获得叶蝉核酸序列共6条，其中4种叶蝉若虫（样本A、B、C、D）的4条序列属首次获得，2种叶蝉成虫（样本E、F）的2条COI序列在新疆首次报道。经NCBI数据库中的BLAST程序，发现与该序列同源性最高的是昆虫的COI基因序列，确定所测序列为COI基因序列。下载GeneBank中与该COI序列同源性较高的叶蝉的序列，将测序获得序列与下载序列用ClustalX1.83软件比对分析，非保守区域去除，测序拼接后仅以表6中的序列长度进行分析。COI基因核苷酸组成见表3，本研究6个样本的COI序列的A+T含量分别为65%、72%、67%、69%、67%、68%，COI基因的A+T含量高于G+C，A+T碱基偏移性明显，与昆虫mt DNA基因碱基构成特点一致，成功对叶蝉样本的COI基因序列在分子水平上监测分析。

表3 mt DNA核苷酸碱基组成表

2.3 分子鉴定结果分析

将获得的叶蝉样本的COI序列在GenBank中进行比对，可获得相似度高低排列表，结果显示均和叶蝉相关序列的相似性最高。COI序列覆盖度大于90%、相似度大于95%，被认定为达到鉴定标准[39]。COI序列相似度大于98%被认为达到鉴定标准或水平[40]。本研究获得的6条COI基因序列中，3个叶蝉样本与NCBI中相关序列相似度高达98%，大于或等于鉴定标准98%，可以鉴定为该类昆虫，鉴定依据和结果如表4所示。样本A与KR564712.1条沙叶蝉Psammotettix confinis COI基因的相似度为99.02%，确定为条沙叶蝉。样本B与MF716879.1大青叶蝉Cicadella viridis COI基因的相似度为99.09%%，确定为大青叶蝉。样本E与JQ755806.1多态广头叶蝉Macropsis notate COI基因的相似度为100%，确定为多态广头叶蝉。样本C与HQ929177.1红带铲头叶蝉Hecalus arcuatus的相似度只有85.5%，未达到鉴定标准，经形态特征鉴定初步鉴定为铲头叶蝉亚科Hecalinae铲头叶蝉属Hecalus Stal叶蝉，由于该样本为若虫，尚未发育完全，形态特征不明显，无法将其鉴定到种，故该叶蝉鉴定为铲头叶蝉属叶蝉。样本D与KR560629.1斑叶蝉族Erythroneura vitifex的相似度只有87.7%，未达到鉴定标准，经形态特征鉴定初步鉴定为阿小叶蝉属Arboridia Zachvathin葡萄阿小叶蝉Arboridia kakogawana，（斑叶蝉属Erythroneura和阿小叶蝉属Arboridia均属斑叶蝉族）。样本F与JF737032.1六点叶蝉Macrosteles sexnotatus的相似度最高，达到91.92%，但未达到鉴定标准，经形态特征鉴定初步鉴定为殃叶蝉亚科Euscelinae二叉叶蝉属MacrostelesFieber六点叶蝉Macrosteles sexnotatus，形态特征与分子鉴定结果一致，该叶蝉为六点叶蝉。本研究中叶蝉样本的形态特征鉴定结果与分子鉴定结果基本一致，样本C、D、F的COI基因序列相似度与NCBI中相关叶蝉的相似度存在一定的差距，与样本的虫态、新疆对叶蝉的条形码研究较少数据库中数据不够全面有关。

表4 叶蝉样本COI基因鉴定依据及结果

2.4 碱基替换饱和性分析

启动DAMBE7.2.136软件，P距离位于横轴，转换(s)和颠换(v)位于纵轴，绘制函数曲线图，以此检测碱基替换是否饱和[41]，详见图2。由图2可知COI序列组的转换值随着P距离增加而升，与P距离存在较强的线性关系，可知本研究中序列碱基替换未饱和，可进行系统进化地位分析[41]。

图2 叶蝉COI基因序列碱基替换饱和性

2.5 叶蝉系统发育分析

从NCBI数据库筛选下载覆盖度大于90%、同源性80%以上的叶蝉科昆虫的COI基因序列，与实验所得序列，用MEGA7.0.14构建COI叶蝉部分属种NJ分子进化树（图3）。本研究分析的6种叶蝉在系统发育树上的位置清晰，分类明确，各种在各分类阶元间形成各自独立的单系。本研究样本的CO1序列和叶蝉类昆虫相关序列分为2个大支，属间以亚科为分支聚类为6个小支，和已知叶蝉相关序列以较高置信值聚在一起，明显将6种叶蝉准确区分开来。阿小叶蝉属位于进化树的根部，是叶蝉科最为原始的类群[42]。

图3 与叶蝉相关的部分种类的COI基因系统进化NJ树（数字表示置信度，用红色菱形标注样本）

2.6 遗传距离分析

用MEGA 7.0.14软件，基于K2P距离模型，计算6种叶蝉不同个体的COI基因序列间的遗传距离，如表5所示。6种叶蝉种间遗传距离为0.183～0.265，种间遗传距离平均数为0.232；鉴定到种的样本A、B、E种内遗传距离分别为0.0037、0.0019、0.0037，远低于0.01。种内平均遗传距离小于0.01，种间平均遗传距离大于0.2，符合“10倍阈值定律”[40]且与形态分类结论一致[43]，对6种叶蝉成功分类鉴定，因此，这些mt DNA序列可以作为鉴定叶蝉科昆虫的DNA条形码[44]。

表5 6种叶蝉COI基因种间遗传距离

3 讨论

3.1 叶蝉mt DNA碱基组成特征

本研究中6个样本的COI基因序列A+T含量明显高于G+C，表现出明显的A/T碱基偏嗜，与昆虫线粒体基因序列碱基组成特点一致[45]。高娅蓉等研究小叶蝉亚科5个族的COI基因片段序列时得出小叶蝉亚科5个族A+T含量为69.2%，含量较高[46]，与本研究结果一致。确定了mt DNACOI基因序列可作为叶蝉的DNA条形码，获得COI基因序列6条，其中4条叶蝉若虫的COI基因序列为叶蝉科昆虫首次报道，2条叶蝉成虫序列为新疆首次报道。

3.2 叶蝉mt DNA分子鉴定结果

本研究中样本C、D、F的COI基因序列与NCBI数据库中相关叶蝉的COI基因序列相似度之间有一定差距，未达到鉴定水平。经查证葡萄阿小叶蝉COI基因序列在各类网络数据库中均未记录，故本研究中获得的样本D葡萄小叶蝉的COI基因序列与斑叶蝉族叶蝉相似度较低。另外新疆温差较大、干燥少雨、光照强，地理环境特殊，区域内相关昆虫研究较少，获得的数据未在条形码数据库中登记，造成新疆叶蝉科昆虫在GenBank数据库中序列不全，相似度低；另一方面在实验过程中因机器或人工的中间环节较多，影响实验结果，而给鉴定结果造成一定误差，数据被误传到数据库，造成同一物种相似度存在差异。

3.3 叶蝉mt DNA基因的遗传距离

研究发现绝大多数物种间的COI基因序列之间存在相对较小的种内遗传距离和相对较大的种间遗传距离，98%以上的种间遗传距离大于2%，而种内遗传距离大多低于1%，很少超过2%[47-48]。本研究6种叶蝉种间遗传距离平均数为0.232，样本A、B、E种内遗传距离平均数为0.0031，远低于1%，达到鉴定标准。样本E与F的遗传距离最大为0.265，样本A与C的遗传距离最小为0.183，来自吐鲁番的样本D与来自喀什、克州的其他样本的地理距离最远，但遗传距离并不是最大的，田小娟指出地理间距和遗传差异之间无相关性[49]，地理距离不会必然导致种群间的遗传分化[49]。李乐对12种假眼小绿叶蝉的研究发现，全国不同地理位置、海拔和气候的假眼小绿叶蝉种群间遗传变异不明显[50]，与本研究结果一致。本研究中地理环境并不是引起叶蝉遗传结构差异的主要原因，但本研究采集的样本地域覆盖度还较低，不能代表该区域的叶蝉遗传结构与地理环境的关系，今后将扩大边境区域及周边采样范围，以期更全面评估该区域叶蝉遗传多样性、分布特点等。

4 结论

本研究基于mt DNACOI基因，首先通过形态分类法确定叶蝉的大致类群，再利用DNA条形码技术，获得叶蝉COI基因序列，比对序列相似性，分析碱基含量、检测系统发育信号、计算遗传距离、构建系统进化关系，确定了6条mt DNACOI基因序列可作为叶蝉快速鉴定的DNA条形码，其中4种叶蝉若虫的基因序列为叶蝉科昆虫首次研究报道。本研究获得如下结论：（1）经形态特征鉴定，6个样本分属6个亚科、6个属、6种叶蝉；（2）叶蝉的mt DNA基因序列构成特点与昆虫的mt DNA序列碱基组成特点一致；（3）通过mt DNA序列对比、遗传距离分析、系统发育构建，确定了本研究6种叶蝉的种类，与形态分类结果一致，获得基因序列可作为本区域6种叶蝉快速鉴定的DNA条形码。