微流控芯片在农产品安全检测中的应用

王东鹏，叶 诚，廖小丽

（武汉海关技术中心，武汉 430050）

0 引言

“民以食为天，食以安为先”，随着食品工业在全球工业生产力的推动下发展规模迅速扩大，国内外的食品安全事件也频繁发生，北美新鲜菠菜和胡芦巴芽急性大肠杆菌感染，导致多数感染者出现肾功能衰竭甚至死亡[1-2]，食品安全不仅危害人类身体健康，对国家经济也造成了巨大损失，据世界卫生组织报道，2011年大肠杆菌O104:H4爆发对德国经济造成近13亿美元的损失[3]。食品安全已成为全球公共卫生话题[4-5]。

食品安全涉及食品的生产、加工、储存和运输等环节，有效解决食品安全问题需要对上述过程进行全面监控，任一过程疏忽都可能引发重大食品安全事故。食品安全检测与分析是监督食品安全和控制食品污染的重要手段，由于食品种类多样、组分复杂和杂质繁多，对食品中有害物质、非法添加剂和残留物等高效快速、准确可靠的现场检测成为当下分析的主要难点之一[6-7]。传统的食品安全检测技术常基于仪器分析，如核磁共振、红外光谱、原子吸收光谱法、荧光光谱法、免疫色谱法[8-9]、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)和气相色谱-质谱法(GC-MS)[10-11]等，这些技术虽具有高灵敏度、高分离效率、适用范围广和定性定量准确度高等优点[12]，但仍具有一定的局限性，如需要昂贵的大型仪器、样本前处理复杂且周期较长、试剂的消耗多，同时需要专业技术人员进行检测分析，因此迫切需要研制出可以满足现场、实时快速、高效便携和可在线检测食品的技术和方法[7]。

微流控芯片，又称为芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是依靠表面张力、流体阻力、能量耗散等一系列特殊效果来控制流体流向、缩短反应时间的微型实验室[7,13-14]。微流控芯片将分析化学、材料学、电子科学、机械科学、分子生物学和医学等领域涉及的样品前处理、分离和检测等过程集成到小型芯片上，有利于实现样品前处理和检测分析的自动化、集成化、小型化、低消耗、高效率和便携化[7,15-16]。与传统方法相比，微流控技术满足了现场、实时检测的需求，且一定程度克服了培养时间长、前处理复杂的缺点，其具有的小型化、高通量、快速、集成化和消耗少等优点，已被各领域科学家充分利用[17-18]。因此，综合分析微流控芯片在农产品安全检测中的应用对农业发展和消费者安全具有一定的指导意义。

1 微流控芯片在农产品安全检测中的应用

1.1 食品成分检测

微流控芯片因具有低成本、高灵敏度、微量在线检测和高效便携等优点[19]，已成功应用于水果、饮料、茶叶、啤酒和食盐成分的检测。智能手机与微流控芯片结合，实现了同时对图片信息采集、识别和分析，可以简捷、快速、在线检测水果中葡萄糖、果糖和维生素C的含量，对葡萄糖的检测限为1.0 mmol/L[20-21]。纸基微流控芯片-电流法也可用于葡萄糖的检测，它将葡萄糖氧化酶固定在纤维基纸盘上，利用二茂铁羧酸作为葡萄糖催化氧化的调节剂，形成电流型葡萄糖生物传感器。由于纸盘具有良好的亲水性，有利于维持葡萄糖氧化酶的催化活性。该传感器已成功应用于不同苏打饮料中葡萄糖的测定，检测限为0.18 mmol/L，结果与HPLC法接近[22]。基于纸基微流控芯片动力学匹配法快速测定茶叶中总多酚(total polyphenol content，TPC)含量，结果表明，该装置可在10 min内完成现场检测，在10～100 mg/L范围内呈现良好的线性关系(r＞0.9955)，与传统的福林-西奥卡特法(folin-ciocalteu，FC)相比，它的检测结果与FC法相当，但样品和试剂消耗量减少了2～3个数量级。纸基微流控芯片动力学匹配法特别适用于茶叶生产过程中TPC变化的在线监测[23]。

啤酒是世界上仅次于水和茶之后的第三大常用饮料[24]，啤酒中乙醇含量常用来评价啤酒的真实性。基于普通办公用纸研制的乙醇检测装置，通过优化pH、酶、浓度及工作电位等参数后，检测4种不同类型啤酒（Pilsner、Weiss、Lager、和无醇啤酒）中乙醇含量，结果表明乙醇检测限为0.52 mmol/L，定量限为10 mmol/L[25]。

纸基微流控芯片还可用于其他成分的检测，如3D纸基微流控芯片测定抗坏血酸，通过不同方法固定试剂于器件，可以有效地避免试剂间相互影响[26]。基于棉涤线进样通道、过滤区、检测区和“开关元件”开发的新型3D纸基微流控芯片，可用于食盐中碘酸根离子(IO3-)的在线过滤和测定，IO3-在5～250 μmol/L范围内呈线性关系，检测限为2.3 μmol/L[26]。此外，基于直链淀粉和碘的颜色反应制作的纸基微流控芯片可现场测定水稻中直链淀粉含量[27]。

1.2 农药残留检测

食源性疾病作为一类常见疾病，是全球需要积极应对的重要话题[28]，中国作为农业大国，农药使用相当广泛。农药在防治虫害、提高农作物产量方面发挥着不可忽视的作用[29]。然而近年来中国食源性农药中毒发病人数却逐年增多[30-31]。因此，研制高效、便捷、实时测定农药残留的检测技术在保证消费者健康安全方面尤为重要[32]。目前微流控芯片技术已成功应用于水样、蔬菜、水果中有机磷农药残留物的检测。

有机磷农药因能抑制乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)，使乙酰胆碱积聚而引发急性毒性[33]，基于乙酰胆碱酯酶抑制而研制的有机磷农药库仑检测微流控芯片，适用于多种蔬菜中有机磷农药的微量检测，该装置因成本低廉、灵敏度高、操作简单、便携快捷等优点受到广泛关注。库仑微流控芯片检测马拉硫磷在10-6～10-3mol/L范围内具有良好的线性关系，检测限为412 nmol/L[34]。由于有机磷农药种类多样且具有多种毒性，很难测定混合农药的总浓度，并且以酶为基础的生物传感器与不同的传导机制结合，如光学法[35-36]、比色分析法[37-38]，AChE固定方法通常基于物理或化学吸附和共价结合，这可能导致酶分布不均、酶稳定性降低或酶活性变性[39]。值得注意的是，具有3D结构的量子点气凝胶结合微流控芯片制成的新型微流体阵列传感器，可实现对混合农药总浓度的测定，它不仅可以增加酶的稳定性和活性，还能够通过荧光强度变化可视化检测残留物。通过对对氧磷、对硫磷（巴拉松）、敌敌畏和溴氰菊酯4种农药检测，结果表明，对氧磷、巴拉松、敌敌畏和溴氰菊酯的检测限分别为1.2、0.94、11.7、0.38 pmol/L，检测范围为10-5～10-12mol/L，该装置灵敏度高，检测范围广，可用于水果农药残留物的分析[40]。自制的纸基微流控芯片也可检测河水、黄瓜汁和番茄汁中的对硫磷，检测限为9.14×10-8g/mL[41]。蔬菜中敌敌畏的检测可以采用发光氨-H2O2化学发光体微流控芯片，它对敌敌畏的检测限为3.6 ng/mL，敌敌畏在10～1000 ng/mL范围内呈现良好的线性关系，并且水溶性金属离子和水溶性维生素不干扰实际样品中0.1 μg/mL敌敌畏的测定。该方法无需对样品进行复杂的前处理，目前已成功应用于白菜、黄瓜和番茄中痕量敌敌畏的检测，优于HPLC法[42]。具有激光诱导荧光(laser induced fluorescence，LIF)检测的微流控芯片电泳技术，使用一次性环烯烃共聚物微流控芯片和低成本的LIF检测器最大限度降低了分析成本，且操作简单，样本无需浓缩即可检测，可快速灵敏地分析草甘膦和草铵膦残留物，草甘膦和草铵膦的回收率分别为84.0%～101.0%和90.0%～103.0%，检测限分别为0.05 g/L和0.02 g/L。该装置分析速度快、具有优异的干扰耐受性，已应用于黄河水、西兰花和大豆样品中有机磷酸酯类的现场快速筛查[43]。与LIF检测器原理（光学原理）相似，根据光的吸收反射原理提出的纸基微流控芯片光电检测法表明，检测分辨率为0.002 mg/L，检测限为0.05 mg/L，检测结果与便携式农药检测仪检测限接近，但优于速测卡法。在试剂消耗上分别是农药检测仪及农药速测卡的5.21%与41.7%，且检测时间缩短了23%[44]。

有机溶剂萃取结合溶剂蒸发微流控芯片技术的出现减少了样品检测过程中假阴性结果，同时也消除了溶剂对AchE检测的影响。生菜样品中辛硫磷、西维因、虫螨威、甲胺磷的回收率在75.2%～111.7%之间，与超高效液相色谱-质谱法回收率相当。有趣的是，该方法还能从极稀样品（如地表水或果汁）中直接预富集农药，对浓度较低的样本进行定性和半定量分析[45]。施杰[41]利用自制的纸基微流控芯片检测河水、黄瓜汁和番茄汁中的西维因，结果表明，西维因的检测限为3×10-9g/mL，回收率为92.3%～115%，95.7%～111%，94.5%～110%，比有机溶剂萃取结合溶剂蒸发微流控芯片技术的回收率高。

1.3 兽药残留检测

与农药相似，鉴于兽药的广谱性和共通性，兽药在兽医学中常用于治疗泌尿系统和消化系统疾病[46]。然而，兽药的大量使用导致肉类食品中出现兽药残留，肉类食品中的兽药残留又会通过食物链进入人体，对消费者的身体健康造成不利影响（急性中毒、慢性中毒、过敏和致癌等）[47]。因此，开发高效便捷的技术检测肉类食品中的兽药残留至关重要。基于微流控芯片-电化学检测技术分析牛肉中4种四环素类抗生素，在微粒体通道中完成抗生素的预浓缩、分离和电化学检测，通过优化缓冲液浓度、进样时间、SDS浓度和分离电压，抗生素在150 s内分离，土霉素、四环素、金霉素和多西环素检测限分别为 1.5、4.3、1.9、2.1 nmol/L，与HPLC（回收率为70%左右）法相比，该装置回收率在80%～93%之间，优于HPLC法。与传统的胶束毛细管电泳电化学检测法(micellarelectrokinetic chromatography-electrochemical detection，MEKC-ED)相比，微流控芯片-电化学检测灵敏度提高了约10900倍，有利于牲畜产品中兽药残留的检测分析[46]。

微流控芯片结合三重四极杆质谱在线同时检测鸡肉样品中喹诺酮类和金刚烷胺。结果表明，样品在1～200 ng/mL(R2＞0.992)呈现良好的线性关系，检测限为0.018～0.043 g/kg，回收率在85.2%～122%之间。与传统的LC-MS（分析时间为1～4 h）法相比，样品无需额外的预处理步骤，在微流控芯片上即可完成过滤、预浓缩、洗涤、洗脱和检测，整个分析时间小于30 min，同时有机试剂消耗减少了约50～100倍。此方法可同时分析多种药物，样品和试剂消耗少，显著缩短分析时间，已成功应用于鸡肉样品中诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙氟沙星、达氟沙星和金刚烷胺的在线同时测定[48]。同样的，微流控芯片与质谱结合也可用于牛奶样品中诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、环丙沙星、依诺沙星的检测，它集样品提取、免疫亲和富集、磁分离和在线洗脱于一体同时进行。结果表明，线性范围为0.2/0.5～10 ng/mL(R2＞0.991)，检测限为0.047～0.490 ng/mL[49]。

1.4 食品添加剂检测

食用色素常用于增强食品的鲜亮程度[50]，然而食用色素残留物对公共卫生有害，如辣椒粉中的苏丹红。苏丹红是一种工业染料，是辣椒粉、果酱和婴儿食品中的非法添加剂，具有致癌性，严重危害人类健康[51-52]。因此，对于快速、灵敏的鉴定苏丹化合物的技术需求越来越大。检测苏丹红的常用方法是酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和HPLC法，大多数ELISA试剂需要数小时才能产生结果，并且HPLC仪器昂贵且耗时。尽管微流控免疫分析可以缩短多步分析中某一步骤的分析时间，但总分析过程仍然很耗时。然而真空加速微流控免疫分析(vacuum-accelerated microfluidic immunoassay，VAMI)利用抗原-抗体识别原理，将两层芯片中的滤膜形成的微流控免疫反应器置于在与泵相连的真空室中，以加速免疫测定。抗原与抗体反应可在芯片中形成荧光方块，与常规微流控免疫分析时间(60 min)相比，VAMI可将时间缩短至15 min，还可以提高灵敏度、操作简单、试剂消耗少（只需要几微升试剂和样品）。利用此装置检测苏丹红，检测范围为0.6～600 ng/mL，相比于HPLC(9 ng/mL)和 ELISA(1.7 ng/mL)的检测限，VAMI检测限可低至1 ng/mL。此外，由于VAMI可以通过小型化设备轻松放大以进行高通量检测，因此更适用于抗原-抗体识别的现场检测[53]。值得注意的是，由金纳米棒(gold nanorods，GNR)和单-6-硫代-环糊精(mono-6-thio-cyclodextrin，HS-β-CD)组成的功能化滤纸芯片，不仅可以对食品中添加的苏丹红进行检测，还可以通过简单的操作有效地从非法掺假的龙血竭（中药名，剑叶龙血树的树脂）样品中收集苏丹染料。该装置中GNR可有效增强表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman spectroscopy，SERS)，此外，CD-GNR通过静电吸附和氢键均匀地组装在滤纸纤维素上，因此CDGNR纸基对苏丹III(0.1 μmol/L)的测定表现出更高的灵敏度，苏丹III和苏丹IV的检测限分别为0.1 μmol/L和0.5 μmol/L[54]。

与苏丹红类似，硝酸盐或亚硝酸盐由于可以增强卤肉等熟食色泽，同时作为防腐剂而广泛应用于食品加工生产过程。过量添加硝酸盐或亚硝酸盐可能是导致食物中毒的主要原因[55]。基于纸上过氯乙烯树脂选择性通过亚硝酸根离子并结合微流控芯片制成的纸基过氯乙烯树脂微流控芯片已成功应用于水样和食品中亚硝酸盐的测定，结果表明，亚硝酸根离子线性范围和检测限分别为70～1500 μmol/L和48 μmol/L，检测限低于HPLC法[56]。基于“开关元件”控制每步反应时间并利用棉涤线作为进样通道研制的3D纸基微流控芯片，也可以测定水分中的亚硝酸根离子，结果表明亚硝酸根离子浓度在10～400 μmol/L范围内线性关系良好[26]。此外，亚硝酸盐还可采用3D纸基微流控芯片结合比色法检测，此法在三维纸芯片的不同层上固定了亚硝酸盐检测试剂，可以实现亚硝酸盐的快速定量检测，在0～10 mg/L的浓度范围内具有良好的线性关系(R2=0.9920)，最低检测限为2 mg/L，加标回收率为91.4%～102.0%。亚硝酸盐纸芯片简单易用、稳定可靠、成本低、耗样量少、灵敏度高，能快速实现亚硝酸盐的检测[57]。基于新型印刷电路板开发的比色分析微流控芯片，可对样品自动分析，无需使用注射器、泵或阀门等，展现出高灵敏度、便携化、微型化和低成本的优点。结果表明，亚硝酸盐的检测限为5 μg/L，回收率在93.5%～107.0%之间，该装置已成功应用于火腿、卷心菜、芹菜、橙子和豆腐中亚硝酸盐的检测[58]。

与硝酸盐或亚硝酸盐类似，苯甲酸也是食品中常见的防腐剂，Liu等[59]开发的纸基微流控芯片通过检测区域颜色变化将检测结果传送至智能手机，此装置与HPLC法结果接近，已成功应用于市场上酱油、萝卜干和辣椒酱等21种食品的苯甲酸检测。

1.5 重金属检测

重金属中毒是影响食品安全的另一主要原因[60]，重金属如铅(Pb)、镉(Cd)、锌(Zn)、汞(Hg)、砷(As)、银(Ag)、铬(Cr)、铜(Cu)、铁(Fe)和铂金(PT)等一般很难降解，不仅对环境造成持续污染，还能通过空气、食物和水分进入人体引发癌症等多种疾病[60-62]。因此，开发快速、可靠的重金属检测方法具有重要意义。传统的重金属检测法主要是火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体光发射光谱法和电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS)等，这些方法都是基于固相萃取柱对金属离子预处理，耗时费力，且分析仪器昂贵，对分析低于检测限的痕量金属离子仍然具有挑战性，使它们在现场筛选和监测中无法应用，微流控技术的出现实现了对重金属离子的现场测量。

玄翠娟[26]在一个装置中同时使用2个进样带和检测区制作的新型双通道纸基微流控芯片，实现了双通道微流控测定汞离子。微流控芯片与光致发光氧化石墨烯传感器(graphene oxide quantum dot，GOQD)结合实现了对痕量铅离子的现场检测，样品在芯片上预处理的同时通过阳离子交换树脂对痕量金属离子预浓缩，利用荧光GOQD传感器对水样中铅离子检测，检测限为0.64 nmol/L，检测范围为1～1000 nmol/L[63]。利用3D打印制作的具有所需形状的电化学微流控芯片，对重金属离子具有优异的电化学检测特性，通过对样品中镉和铅的测定，结果表明，镉离子的线性范围为0.5～8 g/L，检测限为0.5 g/L，铅离子的线性范围为10～100 g/L，检测限为0.2 g/L，检测结果比世界卫生组织提出的指南值低约6倍和50倍，该装置具有良好的稳定性和再现性，特别适用于家庭和资源匮乏的地区[64]。

上述微流控芯片检测多用于单一成分的检测（结构类似物或化学相似物），而荧光标记的单链DNA功能化的石墨烯氧化物传感器是一种低成本、制作简单的纸基微流控芯片，可以同时测定食品中多种化学物质，如重金属（汞和银）以及氨基糖苷类抗生素（新霉素），汞离子、银离子和新霉素的检测限分别为121、47、153 nmol/L，加标回收率分别为87%～116%、91%～126%、95%～101%[65]。基于磁性编码适体探针与微流体芯片相结合的方法，可同时对重金属离子（铅离子）、抗生素（卡那霉素）和雌激素（17β-雌二醇）痕量检测，结果表明卡那霉素、17β-雌二醇和铅离子的检测限分别为1.76×10-4nmol/L、1.18×10-4nmol/L和1.29×10-4nmol/L，该装置不仅可以同时测定食品中的有机物和无机物，还可以重复使用，可用于检测至少4000个样本。该装置已成功应用于牛奶、鱼和猪肉中卡那霉素、17β-雌二醇和铅离子的检测。通过与国家标准方法（电化学、荧光法等）对比，该方法具有明显的选择性和准确度[66]。基于编码发夹探针修饰的搅拌棒结合微流控芯片同时测定汞离子和银离子，可以重复检测至少3000次，汞离子检测限为0.054 nmol/L，线性范围为0.18～50 nmol/L，银离子检测限为0.038nmol/L，线性范围为0.12～100nmol/L，汞离子回收率为90%～115%，银离子回收率为90%～110%，结果与ICP-MS法结果一致。该装置已成功应用于自来水、牛奶、鱼类中汞离子和银离子的检测。通过与国家标准方法（电化学、荧光法等）对比，该方法具有明显的选择性和准确度[67]。基于量子点的荧光传感微流控芯片离子印迹法检测铜离子，线性范围为0.032～3.20 mg/L，检出限为0.012 mg/L。已应用于湖水及海水样品中铜离子含量的检测，与ICP-MS检测结果相比，这种基于荧光传感的印迹纸芯片具有良好的分析性能[68]。一次性纸基传感器能在弱酸性(pH 2.0)条件下，从含Fe3+、AI3+，Zn2+、Cd2+、Pb2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+等金属离子的自然水和废水中选择性的识别Cu2+，Cu2+的检测限和定量限分别为0.06 mg/L和0.21 mg/L，线性范围为0.1～30 mg/L，与原子吸收光谱法的检出限相当。该方法已成功地应用于测定自来水和尾矿水中Cu2+的检测[69]。

2 展望与结语

综上所述，微流控芯片已成功应用于饮品、蔬菜、水果、肉类中食品成分、农药和兽药残留、重金属及食品添加剂的高效便携、准确快速检测。微流控芯片作为一种新技术，集物理学、电化学、材料学、分子生物学、机械科学等为一体，可以实现食品污染物的灵敏、快速检测。但目前微流控芯片仍然处于早期发展阶段，尽管微流控芯片在食品安全检测中展现出巨大的发展潜力，并且微流控芯片与其他检测方法相结合，可以满足多种食品污染在传统检测方法中的限制，但由于其他设备的庞大性，增加了便携检测的难度。值得注意的是，目前的微流控芯片技术多用于食品中单一污染物的检测，对于食品中多种污染物仍然无法满足同时检测的市场需求。因此，开发新型加工材料并推动微流控芯片产业化和市场化是未来发展的新趋势。