丹参-石菖蒲中活性成分丹参素与细辛醚的相关性*

唐一梅，余 双，陈庆庆，2，秦 蓓，张德柱，王晓茹

(1.西安医学院 药学院，药物研究所，陕西 西安 710021；2.成都医学院 药学院，四川 成都 610500；3.陕西盘龙药业集团股份有限公司，陕西 西安 710025；4.陕西功能食品工程中心有限公司，陕西 西安 710065)

“石菖蒲-丹参”开窍醒脑，活血化瘀，但目前文献报道的“石菖蒲-丹参”组方多为临床实践总结，对其物质基础的研究报道很少。

郑晓晖教授课题组研究了使药冰片[1]、郁金[2]、檀香[3]、丹皮[4]、降香[5]等对君药丹参药代动力学的影响，结果发现使药对君药具有增效作用。于洁等[6]研究石菖蒲和丹参配伍后，石菖蒲对丹参药代动力学的影响。结果表明，石菖蒲和丹参配伍后，可以促进丹参在大鼠血液中的吸收程度和速度，增加君药丹参的生物利用度。

离子液体是一种新型的溶剂[7]，具有热稳定性好、蒸气压低、溶解能力强、可设计性等优点[8]，已用于有机合成[9-10]、电化学[11]、生物工程[12]、萃取分离[13-18]等领域。研究以离子液体为辅助溶剂，丹参素、α-细辛醚为检测指标，干预使药中有效成分的提取量，得到的使药提取液作为溶剂提取分析君药有效成分提取量的变化。从分子水平上，阐明君药与使药配伍之后的物质基础变化是密切相关的，两者作用源于有效成分之间存在的相互作用。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

1-甲基-3-丁基-咪唑溴([BMIM]Br),1-甲基-3-辛基咪唑溴离子液体([OMIM]Br)：自制；六氟磷酸钾：化学纯，萨恩化学技术有限公司；丹参素对照品：纯度≥98%，批号KJ0622CA14，上海源叶生物科技有限公司；α-细辛醚对照品：纯度≥98%，批号R27J7Y1678，上海源叶生物科技有限公司；甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；甲酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；丹参：唇形科植物丹参的干燥根及根茎；石菖蒲：天南星科菖蒲属石菖蒲的干燥根茎，均经西安医学院药学院生药教研室汪兴军老师鉴定，分别粉碎，过筛(孔内径：250 μm±9.9 μm)，待用。

高效液相色谱仪：G1312B型1260，美国Agilent公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S型，郑州长城科工贸有限公司；超声波清洗器：SB-5200DT型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备

1.2.1.1 丹参提取液的制备

称取丹参粉末3 g置100 mL圆底烧瓶中，加8倍量的水，浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁热抽滤，合并滤液；用体积比75%甲醇定容至100 mL，得到提取液样品；精密移取1.00 mL样品溶液，用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。

称取丹参粉末3 g置100 mL圆底烧瓶中，加8倍量的水与2.67 mL[BMIM]Br离子液体浸泡30 min，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁热抽滤，合并滤液；滤液加入2.77 g六氟磷酸钾(KPF6)于40 ℃水浴60 min除去离子液体，离心取上清液定容至100 mL；精密移取1.00 mL样品溶液，用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。

称取丹参粉末3 g置100 mL圆底烧瓶中，先加入2.67 mL[BMIM]Br离子液体浸泡30 min，再加入8倍量的水，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁热抽滤，合并滤液；滤液加入2.77 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去离子液体，离心取上清液定容至100 mL；精密移取1.00 mL样品溶液，用75%甲醇定容至10 mL容量瓶。

1.2.1.2 石菖蒲提取液的制备

称取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圆底烧瓶中，加入8倍量的水浸泡2 h，回流提取2 h，提取完成后趁热抽滤，得石菖蒲水提取液；提取液用75%甲醇定容置50 mL，得石菖蒲水体液供试品溶液。

称取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圆底烧瓶中，加入8倍量的水与0.6 mL[OMIM]Br离子液体浸泡2 h，回流提取2 h，提取完成后趁热抽滤；滤液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去离子液体，离心取上清液，得石菖蒲离子液体-水提取液；提取液用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶，得供试品溶液，得石菖蒲离子液体-水供试品溶液。

称取石菖蒲粉末1.5 g置100 mL圆底烧瓶中，先加入0.6 mL[OMIM]Br离子液体浸泡2 h，再加入8倍量的水，回流提取2 h，提取完成后趁热抽滤；滤液加入0.49 g KPF6于40 ℃水浴60 min除去离子液体，离心取上清液，得石菖蒲离子液体(浸泡2 h后)-水提取液；用75%甲醇定容至50 mL的容量瓶，得石菖蒲离子液体(浸泡2 h后)-水供试品溶液。

1.2.1.3 丹参-石菖蒲提取液的制备

按1.2.1.2方法得到的3种石菖蒲提取液补足至固液质量比1∶8，加入到3 g丹参中，回流提取2次，每次1.5 h，提取完成后趁热抽滤，合并滤液，用75%甲醇定容至100 mL，得到丹参-石菖蒲提取液样品；精密移取1.00 mL样品溶液，用75%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取α-细辛醚对照品1.0 mg，丹参素对照品5.0 mg用75%甲醇定容至25 mL容量瓶中，得到ρ(α-细辛醚)=0.04 mg·mL、ρ(丹参素)=0.2 mg·mL-1的混合对照品储备液。

1.2.3 色谱条件

Agilent HC-C18(4.6×150 mm,5 μm)色谱柱；HPLC分析条件：流动相为甲醇-水(质量分数0.2%甲酸)线性梯度洗脱：0～9 min，20∶80；9～12 min，50∶50；12～22 min，70∶30；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：286 nm。

1.4.4 线性范围

吸取混合对照品储备液0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00 mL用75%甲醇至10 mL容量瓶，得到ρ(丹参素)=5、10、15、20、30、40 μg/mL与ρ(α-细辛醚)=2、4、6、8、12、16 μg·mL的混合对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，分别精密吸取10 μL进样，记录质量浓度和峰面积。以峰面积A为纵坐标，质量浓度c为横坐标进行回归计算，得丹参素线性回归方程A=6.0984c-31.5(r=0.994 0)，α-细辛醚线性回归方程A=18.939c-18.05(r=0.999)。结果表明，丹参素在5～40 μg/mL、ρ(石菖蒲)=2～16 μg/mL线性关系良好。

2 结果与讨论

根据《中国药典》2015版附录《药品质量标准分析方法验证指导原则》要求，采用外标法测定供试品中待测成分的含量，方法学考察符合测定要求，结果见表1。

表1 不同溶剂及提取方式对有效成分得率的影响

2.1 离子液体加入方式对丹参素、α-细辛醚的影响

以水、离子液体-水为溶剂提取剂时，获得丹参、石菖蒲供试品溶液分析结果，见图1。

不同溶剂体系

由表1、图1可知，当用水-离子液体混合溶剂提取时，丹参素的得率明显高于水提取的丹参素的得率，石菖蒲中α-细辛醚的得率也高于水提取的得率，且离子液体浸泡后加水再浸泡后提取，有效成分得率均高于离子液体-水混合浸泡的得率。

离子液体浸泡后加水提取，应分2种情况，(1)离子液体浸泡(超声)后直接加水提取；(2)离子液体浸泡后加水再浸泡。这2种情况结果不同，纯离子液体浸泡目的在于离子液体能够溶解纤维素、破除细胞壁，利于有效成分释放。当离子液体溶解了纤维素、破除细胞壁后，再继续用离子液体-水溶剂浸泡，目的是利于有效成分更好转移到溶剂体系中。因此，在一些文献中出现离子液体浸泡后，提取获得有效成分反而低于离子液体-水混合后浸泡有效成分的提取得率[19]。

总之，离子液体的加入，有效成分提取得率提高，这与离子液体的独特属性有关，具有很好的传质作用，破坏了植物的细胞壁，从而加速药材中有效成分的溶出[20]。

2.2 不同溶剂种类对丹参素以及α-细辛醚得率的影响

丹参-石菖蒲混合供试品溶液分析结果，见图2。

不同溶剂体系

由表1、图2可知，丹参素的得率在提取剂为水-石菖蒲(离子液体浸泡后加水)提取液的条件下最高，提取剂为水-石菖蒲(离子液体水混合)提取液得率次之，水-石菖蒲提取液进行提取时得率最低。

相反，当水-石菖蒲提取液为提取溶剂时所得的混合溶液中α-细辛醚的得率最高。分析其原因可能由于加入离子液体的石菖蒲提取液再对丹参进行提取时因为要除掉离子液体时进行的40 ℃水浴时导致石菖蒲中挥发性成分有所损失。

2.3 不同溶剂对丹参素得率的影响

丹参不同提取方式，供试品溶液测试结果，见图3。

不同溶剂体系

由图3可知，当提取液中有石菖蒲时，所得的丹参素得率均比没有石菖蒲有效成分时的得率要高，分析其原因可能由于石菖蒲中的有效成分与丹参素有弱的相互作用，进而导致丹参素的得率增加。由表1可知，α-细辛醚的量相对减少，可能是石菖蒲中提取液中其他有效成分增加，这些有效成分与丹参素有着弱的相互作用力，从而导致丹参素得率增加。通过研究，表明单一检测α-细辛醚的量不足以表明君-使药对之间的作用机制。石菖蒲的有效成分主要为挥发性成分，其中一部分溶于水的小分子可能与丹参素有着弱的相互作用力，从而导致丹参素的得率增加。

总之，离子液体作为一种表面活性剂，本身就有着传统溶剂无法比拟的优点，作为绿色溶剂，离子液体能破除细胞壁，破坏纤维素使有效成分溶出。

君-使药对构成的药对体系是一个复杂的物质体系，配伍之后之所以能够产生协同作用，从化学的角度分析，这与药对配伍之后在分子水平上的物质基础变化是密切相关的，其本质原因是君药和使药在体内各自有组效应物质，这2组效应物质之间协同作用，加上机体的调和作用，从而起到相应的疗效。

3 结 论

研究充分说明石菖蒲中的挥发性成分可能与丹参素有着弱的相互作用力，这能够阐明“君-使”对药引经、增效实质，为研究复方配伍规律的体内物质基础和作用机理，开发高效创新药物提供新参考。