向日葵种子甲基磺酸乙酯诱变体系优化与分析

郭树春，苗红梅，张艳芳，于海峰，聂 惠，邵 盈，乔慧蕾，牟英男，梁 晨，李素萍

（1.河南省农业科学院 芝麻研究中心，河南 郑州 450002；2.内蒙古自治区农牧业科学院 作物科学研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；3.内蒙古农业大学 园艺与植保学院，内蒙古 呼和浩特 010011）

向日葵（Helianthus annuus L.）是菊科向日葵属的重要特色油料作物，也是一种重要的观赏植物，向日葵籽还是一种主要的休闲食物[1-2]。向日葵可分为油用向日葵、食用向日葵和观赏向日葵。向日葵具有耐盐碱、耐干旱、耐瘠薄、适应性强的特点，广泛地分布在欧洲、亚洲、美洲等地的干旱半干旱地区，是许多国家或地区的主要经济作物。在我国，向日葵年种植面积稳定在100 万hm2左右。近年来，在我国几代向日葵育种工作者的努力下，已经选育出一系列高产、优质，并适宜本土种植的新品种，如油用向日葵品种“康地108”“内葵杂3 号”，食用向日葵品种“SH363”“JK601”“科阳1 号”等，我国自育向日葵种子的市场占有率逐渐增加。然而，由于我国向日葵种质资源遗传背景相对狭窄，长期以来我国的育种者只是通过传统的方法（回交、杂交育种等）改良材料或选育新品种，未能从根本上拓宽我国向日葵的遗传背景。因此，需要一种新的资源创新手段，从根本上拓宽向日葵的遗传背景、创新向日葵种植资源以打破我国向日葵传统育种遗传多样性狭窄的壁垒。

20 世纪化学诱变育种被发明，广泛地应用于不同作物的材料创新。多年的试验证明，甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）诱变技术是一种稳定性好、诱变效率较高的技术。EMS 化学诱变原理是其被植物细胞吸收后，转变成的缺电子活泼中间产物，并容易与碱基上的N 原子和磷酸基团发生亲核取代反应，使DNA 发生突变[3]。相对于传统育种技术或分子育种技术，该化学诱变技术具有使用方便、特异性较强、诱变后代较易稳定遗传、不易对染色体造成畸变的优点。基于以上原因现已在拟南芥[4-5]、大豆[6-7]、小麦[8-10]、水稻[11-12]、芝麻[13-14]、亚麻[15]、葫芦[16]、红薯[17]、玉米[18]、油菜[19]、番茄[20]等作物上广泛应用，在拓宽作物的遗传背景、创新作物种植资源中发挥了重要作用。但诱变向日葵种子使用EMS 方法的研究较少，以航天诱变为主[21-22]。

向日葵原产地在北美，导致我国向日葵种质资源的遗传多样性严重不足，严重影响了我国向日葵品种产出的质量。然而，利用传统的方法（调查引种、有性杂交、回交等途径）对我国向日葵种质资源的创新，存在创新速度慢、创新动力不足等缺陷。因此，开发一种新的、可靠的向日葵资源创新方法迫在眉睫。2017年，向日葵全基因组信息的破解，标志着向日葵材料创新方法正在从传统选育方法向功能基因组或后基因组学时代迈进，这给向日葵育种家带来了新的机遇，同时带来了新的挑战。在基因组水平触发多种向日葵的基因突变可以从中获取所需的性状；利用现代化学诱变加速甲基磺酸乙酯（EMS）诱变，触发向日葵基因诱变，并构建向日葵突变体库，结合现代转录组、基因组、蛋白组等测序技术手段，加快向日葵育种进程，EMS 诱变技术为向日葵资源材料创新提供技术基础，为向日葵分子设计育种以及抗性、品质相关基因的挖掘提供可靠突变体。在我国利用EMS 诱变向日葵种子的研究较少，因此，本试验开展了EMS 诱变向日葵突变体筛选，旨在拓宽向日葵种质资源多样性。

1 材料和方法

1.1 材料

选取油用向日葵JK103、S18 和食用向日葵科阳7 号、巴葵138 为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 EMS 溶液配制 0.1 mol/L、pH 值7.4 的PBS磷酸缓冲液配制：称取十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）21.8 g、二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）6.08 g，用双蒸水定容至1 000 mL，将pH 值调至7.4；在PBS 磷酸缓冲液中加入EMS，配制成0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS 溶液。

1.2.2 选种 选取饱满度、大小一致且无破损的JK103、S18、巴葵138、科阳7 号种子各100 粒，设3 次重复。

1.2.3 催芽 将种子整齐摆放在铺有双层毛巾的塑料盒中（15 cm×20 cm），每盒3 层种子为宜。用喷壶均匀喷洒蒸馏水直至毛巾完全湿润，将塑料方盒置于22～25 ℃培养箱中，光照14 h 条件下催芽，催芽过程中观察出芽情况。

1.2.4 诱变 选取0（CK）、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% 6 个EMS-磷酸缓冲液浓度梯度和3 个时间处理梯度（6、12、24 h)，共计18 个处理组合，每组合选取100 粒向日葵种子进行处理（3 次重复）。待幼芽刚刚破壳时挑选预发芽种子用EMS 诱变处理，首先用滤纸吸干种子表面水分，然后将种子置于带盖、可密封的器皿中，加入相应浓度的EMS 处理液并加盖密封（此项操作在冰上进行，目的是减少EMS 的挥发），并在器皿上标明EMS 浓度和预处理时间后，置于转速设置为110 r/min 的摇床上振荡。

1.2.5 冲洗 诱变结束后，将每个处理的种子装在小纱袋中，并用标签标注种子编号、诱变时间等信息，后将小纱袋置于适当大小的烧杯中并在流水下冲洗3 h。

1.2.6 播种 用4 层报纸制作直径5～6 cm、高约15 cm 的无底圆柱桶种钵，4/5 种钵中装培养土（营养土∶蛭石= 3∶1 配制培养土），此时培养土表面距离种钵上边缘在3～4 cm 为宜，将种钵排列在一个大小适宜的塑料营养方盒中方便浇水；将各处理种子播种在钵中，用培养土将种钵填满，并在营养盒中注入烧开后冷却的自来水直至种钵表面营养土湿润，后将其在日光温室中培养，7 d 定时浇水2～3 次，保持种钵表面土壤湿润为宜，播种第2 天后，每天8：00—10：00 统计种子发芽情况和幼苗成活情况，连续统计8 d。

半致死EMS 浓度：一定浓度一定时间下，使受试样品半数死亡的EMS 剂量。

1.2.7 统计分析 采用Microsoft Excel 2010 软件进行数据分析并绘图，采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度EMS 和诱变时间对向日葵种子发芽势的影响

播种后第2 天开始观察、记录各品种发芽数，发现油用向日葵种子在播种48 h 后开始破土，而食用向日葵种子稍晚一些，一般在播种48～72 h 后开始破土，多数向日葵品种在播种4 d 后种子发芽数达到高峰，取种子4 d 时的发芽数计算发芽势。

由图1 可知，在处理6 h 条件下，随着EMS 浓度的增加向日葵种子的发芽势变化不大；但是在处理12、24 h 条件下，随着EMS 浓度的增加向日葵种子的发芽势显著（P＜0.05）；食用向日葵种子的发芽势降低的程度较油用向日葵种子明显；油用向日葵种子在EMS 浓度为1.5%时，处理时间超过12 h后，发芽势急剧降至50%以下；而食用向日葵种子EMS 浓度为1.0%时，处理时间超过12 h 后，发芽势迅速降至50%以下，巴葵138 对EMS 诱变反应最为敏感。

由图1 可知，油用向日葵种子对照（CK）的发芽势高于80%，而食用向日葵种子对照（CK）的发芽势为70%左右。油用向日葵JK103 种子在EMS 浓度为1.5%、处理时间为12 h 时，发芽势近50%；在EMS浓度为2.0%、处理时间为24 h 条件下，发芽势不足10%，同样的结果出现在油用向日葵S18 种子中。在食用向日葵种子中，科阳7 号在EMS 浓度为1.0%、处理时间为12 h 时，发芽势近50%；在EMS 浓度1.0%条件下、处理时间延长至24 h 时，发芽势降低到不足20%，相同EMS 浓度下科阳7 号对处理时间敏感；在EMS 浓度为大于1.5%、处理时间超过12 h时科阳7 号发芽势几乎为0；巴葵138 对EMS 浓度和处理时间都比较敏感。

图1 不同浓度EMS 溶液和不同诱变时间对向日葵种子发芽势的影响

2.2 不同浓度EMS 和诱变时间对向日葵种子发芽率的影响

由图2 可知，未经EMS 处理的种子（CK）发芽率最高，其中，油用向日葵JK103 和S18 的发芽率接近100%；食用向日葵科阳7 号的发芽率也近100%，巴葵138 的发芽率平均为90%。用不同浓度EMS 处理后，随着EMS 浓度的增加和处理时间的延长，各品种的种子发芽率有不同程度降低。较低浓度EMS（≤0.5%）、6 h 处理对JK103、S18 种子发芽率较对照（CK）影响不显著（P＞0.05）；巴葵138 的发芽率与对照（CK）相比显著降低（P＜0.05）。在EMS 浓度为1.5%、处理12 h 时，JK103 和科阳7 号的发芽率超过50%，S18 和巴葵138 的发芽率降到20%以下；当处理时间延长至24 h 时，只有JK103 的发芽率达到了50%，S18 的发芽率不到10%，而2 个食用向日葵品种的种子萌发能力完全丧失。当EMS 浓度增加到2.00%、处理时间超过12 h 时，4 个品种的发芽率均较对照（CK）显著降低（P＜0.05）；当处理时间延长到24 h 时，除JK103 还有一定的萌发能力外，其余3 个品种种子萌发能力完全受到抑制。由上述可知，相同EMS 浓度下科阳7 号对处理时间敏感。而在EMS 浓度大于1.5%，处理时间超过12 h 时，科阳7 号发芽率几乎为0；巴葵138 对EMS 浓度和处理时间都比较敏感。油用向日葵种子较食用向日葵种子对EMS 耐受性较强。

图2 不同浓度EMS 溶液和诱变时间对向日葵种子发芽率的影响

2.3 向日葵种子EMS 诱变适宜条件分析

由图3 可知，JK103 半致死EMS 浓度为1.5%下处理12～24 h；S18 半致死EMS 浓度为1.0%下处理12～24 h；科阳7 号半致死EMS 浓度为1.5%下处理12 h；巴葵138 半致死EMS 浓度为1.0%下处理6～12 h。在向日葵种子相对发芽率最接近50%（半致死浓度）前提下，对于油用向日葵而言，最佳EMS 诱变条件为：EMS 浓度1.0%～1.5%，处理12～24 h；对于食用向日葵而言，最佳EMS 诱变条件为：EMS 浓度1.0%～1.5%，处理6～12 h。根据半致死EMS 诱变确定的适宜诱变条件，油用向日葵EMS 诱变适宜条件为：催芽48 h 后，EMS 溶液浓度1.0%～1.5%，处理12～24 h；食用向日葵EMS 诱变适宜条件为：催芽48～72 h 后，EMS 溶液浓度1.0%～1.5%，处理6～12 h。

图3 不同浓度EMS 溶液和不同诱变时间对各品种相对发芽率的影响

3 讨论与结论

EMS 诱变效果主要影响因素有诱变剂浓度、样品处理时间、处理材料特性[3，23]。试验证明，作物刚刚萌发的种子是理想的诱变材料，育种者们已对许多作物种子的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变体系进行了优化与分析。曹冠男[24]对4 种小麦用EMS 诱导，并对其诱导效应研究，结果表明，小麦的EMS 诱变体系为：诱变剂浓度1.0%，诱变时间8～12 h 为宜；弭宝彬等[25]利用EMS 诱变剂对冬瓜的种子进行了研究，结果表明，该作物的最佳EMS 诱变浓度为1.2%、时间为12 h，在此体系下种子发芽率为54.67%，成苗率为51.83%，该值接近半致死浓度，可以作为冬瓜EMS 诱变的参考值；王春语等[26]研究认为，高粱的最佳EMS 诱变浓度为0.1%；周书栋[27]在辣椒突变体库构建及矮秆突变体筛选与分析中指出：在浓度为1.0%EMS、处理时间为4 h 条件下，辣椒发芽率为45.2%，幼苗成活率为40.2%；程蛟文等[23]在苦瓜EMS 诱变中初步认为苦瓜种子诱变最佳条件：首先清水处理8 h，其次用1.2%～1.5%诱变剂处理2 h；总之，近年来的研究明确了多种农作物种子的EMS诱变剂浓度0.3%～1.5%，诱变时间0.5～24.0 h，不同作物诱变条件差异较大，可根据研究结论设计试验，深入研究确定特定作物的最佳诱变体系。与其他诱变方法相比，EMS 诱变具有操作简单、方便且突变效率高等特点，在植物新种质的创制和突变体库的构建中被广泛应用，但是在向日葵上的研究较少。本研究结果表明，油用向日葵适宜诱变条件为，清水浸种48 h 后，EMS 溶液浓度1.0%～1.5%，诱变12～14 h；食用向日葵适宜诱变条件为，清水浸种48～72 h 后，EMS 溶液浓度1.0%～1.5%，诱变6～12 h。

上述研究结果与已报道的双子叶作物EMS 诱变条件相比，向日葵种子较耐EMS，引起半致死浓度的起始浓度偏高，在油用向日葵种子中这一现象更加明显；随着诱变时间的延长，在诱变后期向日葵种子对EMS 的诱变较为敏感。上述现象与一些种皮较薄的种子（芝麻、小麦、水稻等）正好相反[27]，这可能与向日葵种子种皮厚度、密度和硬度相关，有待后期试验验证。