低温条件下玉米秸秆降解菌复配效果及降解特性研究

张必周，洪 博，张 涛，赵婉彤，于晓芳，高聚林，张 鑫，青格尔

（1.内蒙古农业大学农学院/内蒙古自治区作物栽培与遗传改良重点实验室，内蒙古呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

北方春玉米种植区是我国的玉米主产区，约占全国玉米播种面积的50%[1]。随着玉米种植面积的不断扩大，产生大量废弃的玉米秸秆，因秸秆利用方式单一、有效利用率较低而造成的资源浪费和环境污染也日益严重[2]。研究发现，秸秆还田具有降低土壤容重、改良土壤团粒结构、增加土壤孔隙度[3]、提升土壤有机质、增加农作物产量[4]等多重功效，因此成为目前主要的秸秆利用方式。我国北方地区冬季低温、干旱，限制了当季还田秸秆的有效腐解，且由于秸秆木质纤维素的组成，自然状态下难以被微生物分解[5]，导致秸秆不仅无法作为当季作物的肥源，还会影响播种质量，不利于下茬作物的生长[6]。秸秆微生物促腐还田可加速秸秆分解和腐熟，具有高效、便捷、生物安全等特点[7]，可实现秸秆的高效绿色降解和农业可持续发展。前人通过筛选或复配单菌获得秸秆降解微生物，如崔宗均等[8]从4 种堆肥样品中筛选优化获得纤维素分解能力强而稳定的纤维素分解菌复合系；李静等[9]从川西高原贡嘎山区杜鹃林下土壤中分离纤维素降解菌，并组配获得由类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）以及链霉菌属（Streptomyces sp.）组成的复合菌C 和D，表现出较高的纤维素降解能力。大量研究表明，单一菌株存在酶稳定性差、环境适应能力弱及降解效果差等问题[10]，而复合菌具有微生物协同作用，产酶多样，有利于提高秸秆类物质的转化率[11-12]，对秸秆的降解效果及稳定性显著优于单一菌株[13-14]，但复合菌系组成复杂多样且无法满足发酵工艺要求，致使菌剂的制备及开发较为困难。

本试验在玉米秸秆低温高效降解复合菌系GF-20经分离纯化并组合获得复配菌A3+A4（Achromobacter deleyi strain LMG 3458+Pseudomonas plecoglossicida strain NBRC）的基础上添加功能真菌，组配了菌种组成简单的玉米秸秆低温降解复配菌，并对其复配效应和降解效果进行研究，以期为今后玉米秸秆原位促腐还田提供微生物资源，为制备复合菌剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

玉米秸秆低温高效降解复合菌系GF-20 是内蒙古农业大学玉米科技创新团队筛选获得的菌系[15]，采用稀释梯度法分离纯化获得细菌A3（Achromobacter deleyistrainLMG3458）、A4（Pseudomonasplecoglossicida strain NBRC），并复配获得复配菌A3+A4[16]；供试功能真菌为A（Aspergillus terreus）和P（Phanerochaete chrysosporium），由中国农业微生物菌种保藏中心提供；玉米秸秆取自内蒙古农业大学玉米中心试验田收获的秸秆，纤维素、半纤维素和木质素含量分别为0.576、0.324 和0.164 g/g，洗净烘干后剪成2～3 cm 碎条。

1.2 试验设计

活化的菌株A3、A4、A、P 分别以同等比例组配构建A3+A4、A3+A4+A、A3+A4+P、A3+A4+A+P 复配菌，接种于玉米秸秆培养基中，置于低温15 ℃、黑暗条件下的恒温培养箱静置培养，分别于培养3、7、12、15、20、30 d 取样测定玉米秸秆降解率，滤纸酶、木聚糖酶、漆酶活性，纤维素、半纤维素、木质素降解率和单菌微生物相对含量。

1.3 培养基

基础培养基：（NH4）2SO42 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、CaCO32 g/L、NaCl 0.2 g/L，蒸馏水1 L；玉米秸秆培养基：40 mL 基础培养基，2 g玉米秸秆。以上培养基使用前于121 ℃、0.1 MPa 条件下进行30 min 灭菌处理。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 玉米秸秆及纤维素、半纤维素、木质素降解率的测定 各复配菌以10%（V/V）的接种量接种至玉米秸秆培养基中，培养第30 天收集培养基中的玉米秸秆，用蒸馏水冲洗干净，放入80 ℃烘箱烘至恒重，称量记录，采用失重法计算玉米秸秆降解率，之后粉碎过150 μm 筛，采用纤维素分析仪（ANKOM A200i）测定纤维素、半纤维素、木质素含量，并计算纤维素、半纤维素和木质素降解率，3 次重复。

1.4.2 酶活性的测定 于接种后3、7、12、15、20、30 d取培养液，参照国际理论与应用化学联合会（IUPAC）推荐的分光光度法[17]测定滤纸酶活性，参照国家标准GB/T 23874—2009[18]中的方法测定木聚糖酶活性，采用ABTS 法[19]测定漆酶活性，3 次重复。

1.4.3 微生物相对含量的测定 于接种后30 d 在无菌条件下吸取培养液5 mL，采用微生物DNA 提取试剂盒（中国，天根生化科技有限公司）进行DNA提取。设计4 株单菌引物，对目的基因进行PCR 扩增。RT-qPCR 反应体系（20 μL）：ChamQ SYBR COLOR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 个循环；95 ℃30 s，60 ℃1 min；95 ℃30 s。每个样品3 次重复，通过96 孔板进行检测。细菌采用16S rRNA 基因作为参照，真菌采用ITS 基因作为参照，引物信息见表1。

表1 引物序列

1.5 数据统计分析

采用SPSS v18.0 统计学软件进行单因素方差分析（ANOVA），采用SigmaPlot v12.5 软件制图。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定与降解特性

首先采用梯度稀释法从复合菌系GF-20 中分离纯化获得2 株功能单菌A3 和A4，经滤纸培养基筛选，菌株A3 和A4 可使滤纸条断裂，且分泌木质纤维素降解酶，经分子生物学鉴定A3 为Achromobacter deleyi strain LMG 3458，A4 为Pseudomonas plecoglossicida strain NBRC（图1），并复配获得复配菌A3+A4。然后对复配菌A3+A4 及菌株A3、A4、A、P 的玉米秸秆降解率及相关酶活性进行分析，结果表明（表2），A3 和A4 相互组合后，玉米秸秆降解率显著高于单菌株（P＜0.05），较A3、A4分别增加11.96、12.87 个百分点；滤纸酶活性分别较A3、A4 显著增加10.58、10.76 U/mL（P＜0.05），木聚糖酶活性分别较A3、A4 显著增加0.62、0.64 U/mL（P＜0.05），漆酶活性分别较A3、A4 显著增加10.42、10.85 U/L（P＜0.05）。

图1 菌株A3、A4 系统进化树

表2 不同处理玉米秸秆降解率及相关酶活性

2.2 不同复配菌组合酶活性动态变化

由图2 可知，随着培养天数的推进，所有处理的滤纸酶活性均提高，而所有处理木聚糖酶和漆酶活性均呈先增加后降低的趋势。不同复配菌的滤纸酶、木聚糖酶和漆酶活性分别在培养第30 天、第15 天和第20 天达到最高值，其中A3+A4+A+P 组合显著高于其他组合（P＜0.05），酶活性分别为15.49 U/mL、7.39 U/mL、81.67 U/L，且分别较A3+A4 提高了4.44 U/mL、4.00 U/mL、60.04 U/L。不同组合复配菌总体表现为A3+A4+A+P>A3+A4+A/A3+A4+P>A3+A4，表明在组合A3+A4 的基础上添加功能真菌A 和P 可显著提高酶活性，具有良好的正向效应。

图2 不同复配菌组合酶活性动态变化

2.3 不同复配菌组合对纤维素、半纤维素及木质素降解率动态变化的影响

随着培养天数的推进，各复配菌组合低温15 ℃条件下纤维素、半纤维素及木质素降解率呈上升趋势（表3），培养30 d 时纤维素降解率表现为A3+A4+A和A3+A4+A+P 显著高于其他处理（P＜0.05），降解率分别为36.70%和36.51%；其次为A3+A4+P，降解率为30.28%。半纤维素和木质素降解率均表现为A3+A4+A+P 显著高于其他处理（P＜0.05），降解率分别为33.62%和31.24%；其次为A3+A4+A 和A3+A4+P。复配菌A3+A4、A3+A4+A、A3+A4+P、A3+A4+A+P 的纤维素、半纤维素和木质素降解率最大值均出现在第30 天，不同组合复配菌总体表现为A3+A4+A+P>A3+A4+A/A3+A4+P>A3+A4，且A3+A4+A+P 的纤维素、半纤维素、木质素降解率分别较A3+A4 提高了10.77、4.15 和21.10 个百分点。由降解率可知，在A3+A4 的基础上添加功能真菌A可显著提高30 d 时的纤维素降解率和半纤维素降解率（P＜0.05），添加功能真菌P 可显著提高30 d 时木质素降解率（P＜0.05）。

表3 不同复配菌组合纤维素、半纤维素、木质素降解率

2.4 不同复配菌组合对玉米秸秆降解率的影响

由图3 可知，A3+A4+A+P 的玉米秸秆降解率为38.79%，显著高于其他组合（P＜0.05），较A3+A4 提高了13.04 个百分点。A3+A4+A 和A3+A4+P 的玉米秸秆降解率分别为29.24%和29.16%，较A3+A4分别提高了3.49 和3.41 个百分点。由此可知，添加功能真菌A 或P 的提升效果低于同时添加A 和P。

图3 不同复配菌组合玉米秸秆降解率

2.5 不同复配菌组合对单菌微生物相对含量的影响

由表4 可知，在15 ℃条件下单菌微生物相对含量随着复配菌丰度的增加而增加。A3+A4+A+P 中，4 株单菌的微生物相对含量均显著高于其他组合（P＜0.05），分别为1.53%、1.47%、1.42%和2.04%，说明添加功能真菌A 和P 可有效促进复合菌中单菌株的微生物相对含量，从而提升玉米秸秆降解效率。

表4 复配菌中A3、A4、A、P 微生物相对含量 单位：%

3 讨论与结论

复合菌系GF-20 具有秸秆低温高效降解能力，尤其在纤维素和半纤维素降解方面具有良好的潜力[16]，但因其组成复杂，不利于工业开发。经梯度稀释和分离纯化获得的菌株A3（Achromobacter deleyi strain LMG 3458）和A4（Pseudomonas plecoglossicida strain NBRC）表现出降解功能，复配构建复配菌A3+A4 后，其降解效率显著低于原有菌系GF-20。为了提升降解效率，本试验通过添加功能真菌A（Aspergillusterreus）和P（Phanerochaetechrysosporium）增加菌株组成丰度，并探究各复配菌处理的酶活性、玉米秸秆降解率及单菌微生物相对含量。

本试验中菌株A3 能降解复杂化合物[20]，菌株A4 具有高效的胞外氧化系统[21-22]。功能真菌A 属于降解纤维素真菌[23]，具有较高的CMC 酶活性[24]；P 具有细胞外氧化系统，可编码木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和乙二醛氧化酶，能有效降解秸秆中的木质素[25-26]，但其分泌的纤维素酶和半纤维素酶种类不全[27]，对纤维素和半纤维素降解能力弱。对复杂有机化合物降解及生防菌利用的相关研究发现，将不同功能的单菌相互组配，可显著提升相关功能的作用[28-29]。本试验以具备不同降解活性的4 株单菌为基础进行菌株复配，复配后微生物相对含量显著增加，酶活性及玉米秸秆的降解率显著提升。但并不是菌株组成数量越多越好，江高飞等[30]研究发现，不含菌株Aspergillus fumigatus F7-5 的组合F1 表现出更好的秸秆降解效果。本试验表明，添加功能真菌A可显著提升复配菌的纤维素降解率，同时发现随着功能真菌P 的加入，复配菌漆酶活性显著提升，且A3+A4+P 显著高于A3+A4+A+P，说明功能真菌A对漆酶的提升无显著贡献；添加功能真菌A 可显著提升木聚糖酶活性，A3+A4+P 的酶活性显著低于A3+A4+A 和A3+A4+A+P。自然界中真菌与细菌存在共生关系，FERNÁNDEZ-LUQUEÑO 等[31]研究发现，在对石油烃的降解过程中，细菌和真菌混合降解石油烃的效率是细菌纯培养降解的3 倍。秸秆降解需细菌、真菌等多种微生物及其分泌的纤维素酶相互协同发挥作用，而单一菌株往往难以完成如此复杂的生化过程，真菌与细菌的秸秆降解机理不同，真菌菌丝对木质纤维素结构的破坏可帮助细菌的定殖，细菌对木质纤维素改性更利于真菌纤维素酶对木质纤维素的有效降解[32-33]。研究表明，不同微生物菌株的组合比单一菌株的降解效果好[34]。夏强[35]研究发现，以地衣芽孢杆菌、黑曲霉和绿色木霉组成的细菌-真菌复合菌系产纤维素酶的活力优于单一菌株，显著提高了复合菌系降解水稻、玉米和小麦秸秆的能力。梅新兰等[36]以细菌雷氏普罗威登斯菌JB7、球形赖氨酸芽孢杆菌BB18 和真菌草酸青霉ZA、包围漆斑菌ZL 构建的细菌-真菌复合菌系对水稻秸秆的降解率及纤维素酶、木聚糖酶和滤纸酶活性显著提升。本试验在A3+A4 细菌组合的基础上，添加真菌A 和P，构建含有纤维素降解细菌及真菌，同时含有对木质素降解效果较好的微生物，较A3+A4 玉米秸秆降解率提高了13.04 个百分点，滤纸酶、木聚糖酶、漆酶活性分别提高了4.44 U/mL、4.00 U/mL、60.04 U/L，纤维素、半纤维素和木质素降解率分别提高了10.77、4.15 和21.10 个百分点。加入真菌A. terreus（A）和P. chrysosporium（P）后复配菌中A3和A4 的微生物相对含量较A3+A4 显著增加，这可能与细菌可附着于真菌菌丝生长有关[37]，使其在培养初期免受有害物质的影响，利于细菌生物量的积累。本试验以具备不同降解活性的4 株单菌株为基础进行菌株组合，以滤纸酶、木聚糖酶、漆酶活性及玉米秸秆降解率为指标，确定玉米秸秆低温降解最佳组合为A3+A4+A+P，该组合在低温15 ℃条件下玉米秸秆降解率最高，为38.79%；纤维素、半纤维素和木质素的降解率在培养30 d 时达到最高值，分别为36.51%、33.62%和31.24%；滤纸酶、木聚糖酶、漆酶活性分别在培养30、15、20 d时达到最高值，其值为15.49 U/mL、7.39 U/mL、81.67 U/L，玉米秸秆降解率及滤纸酶、木聚糖酶、漆酶活性均显著提升。