奶牛养殖发酵床不同深度菌群结构及其应用效果分析

韩姗姗，李忠玲，张 强，2，岳淑宁，2

（1.陕西省生物农业研究所，陕西 西安 710043；2.陕西省酶工程技术研究中心，陕西 临潼 710600）

发酵床是将垫料和牲畜粪便（或泥土）混合让其发挥协同发酵作用，快速转化生粪、尿等养殖废弃物，去除养殖臭味，改善奶牛生长环境，实现无污染和低排放［1-2］。发酵床养殖技术包含异位的提前发酵技术和原位的干撒式发酵技术。发酵床的正常运行对养殖场至关重要，影响发酵床正常运行的主要因素包括垫料含水量、翻倒频率、垫料厚度［3］。发酵床内部是一个多菌种参与的复杂生态系统，不同的动物养殖场有不同的内生菌种，发酵床垫料厚度不同［4］。发酵床的维护和适宜厚度既能提高发酵效果，又能促进动物健康生长。该研究将发酵床养殖技术对应的奶牛健康状况、生鲜乳品质及发酵床不同深度的菌群组成结构进行对比，为促进发酵床在奶牛养殖产业中的应用提供支撑。

1 材料与方法

1.1 奶牛养殖场基本情况

试验样本均采集于陕西省西安市阎良区海文畜牧养殖专业合作社，2018年2月开始运行，饲养密度15 m2/头，奶牛共500头，发酵床养殖300头，无发酵床养殖200头。奶牛养殖场采用生物垫料发酵床养殖模式，发酵床已成功运营2年，处于稳定期。

1.2 发酵床的制作

发酵床垫料厚度约为60 cm。垫料的补充料为3种，即稻壳和干牛粪渣（F1），锯末屑（F2），稻壳粉（F3）。

1.3 发酵床的日常管理

每天3次饲喂时间为6:00、12:30和19:00，自由饮水，发酵床湿度控制在50%左右，垫料不定期翻动，保证发酵床垫料的透气性，并根据发酵床含水量适时调整牛群密度和补充新垫料。

1.4 发酵床不同深度样本采集信息

取样用所有工具和容器经过灭菌消毒预处理。以五点取样法［5］，采集深度为表层5 cm（样品编号为A）、中层25 cm（样品编号为B）、深层45～50 cm（样品编号为C）的发酵床样本。以垫料补充料为对照，编号为K。样品采集时间为2020年6月18日、6月25日和7月2日。每层样品3个重复，取样量为10 g，保存于无菌离心管中，置于含干冰的泡沫箱中送至检测实验室。试验期间每日挤奶2次（7:30和14:30），无菌生鲜乳样品（250 mL/每份）采集后置于冰盒，运至实验室后，根据《中国荷斯坦牛生产性能测定技术规范》（NY/T 1450—2007）添加重铬酸钾作为防腐剂，4℃保存。

1.5 理化指标测定方法

样品温湿度测定采用土壤温湿度仪（型号：TR-6，顺科达），氨气浓度和硫化氢浓度测定采用便携式气体检测仪（型号：BH-90，3.7VDC，保时安）。含水量测定参照《土壤水分测定法》（GB 7172—87）。

1.6 细菌计数用培养基

生鲜乳体细胞计数采用体细胞计数仪（Somacount 150）进行。生鲜乳中的菌落总数测定采用稀释样本无菌接种于不同培养基，37℃培养2 d后，检查生长菌落的数量。麦康凯琼脂培养基（Mac Conkey，MAC），北京奥博星生物技术有限责任公司）用于大肠埃希菌的计数。麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂培养基（MacConkey-inositol-carbenicillin agar）用于培养克雷伯菌。COBA培养基（北京陆桥生物技术有限责任公司）用于牛乳腺炎链球菌的选择性分离培养。

1.7 细菌和真菌测序

采用CTAB方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无菌水稀释样本至1 ng/μL。使用带Barcode的特异引物515F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）测定细菌16S rDNA V4区基因，测定真菌ITS1区的特异引物为ITS5-1F-F（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS1-1F-R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）。测序工作由北京诺禾致源生物信息科技有限公司的Illumina Nova测序平台完成。

1.8 数据分析

试验所得理化指标数据用“平均值±标准差”的方式记录，数据分析采用Graphpad Prism8.0软件，不同测定指标与不同深度样品的组间差异性采用单因素方差分析，邓肯法进行多重比较，显著性水平设定为P＜0.05。微生物群落结构即Alpha多样性分析使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算，组间差异分析采用非参数Wilcoxon秩和检验。采用生物信息软件包PICRUSt（适用于细菌16S）和FunGuild平台（适用于真菌ITS）进行微生物基因预测，并在对应的生物学通路数据库中进行比对注释。基于注释结果，对预测的功能同时做t检验差异分析。

2 结果与讨论

2.1 致病菌的分离培养

存在于垫料、草料和卧床等环境中的细菌病原体，包括大肠埃希菌（Escherichia coli）、克雷伯菌（Klebsiella spp.）和乳房链球菌（Streptococcus uberis），是引起奶牛临床乳腺炎的常见原因［6］，因此，发酵床管理是奶牛养殖中特别重要的一个环节。通过对比两组养殖模式下奶牛垫料的环境性乳腺炎致病菌菌落数，采用发酵床的养殖管理方法，3种致病菌的菌落数均低于未使用发酵床的样本。奶牛养殖场有无发酵床养殖的样本致病细菌数对比，见表1。

表1 不同养殖模式的环境性乳腺炎致病菌数量 单位：CFU/mL

2.2 应用发酵床的奶牛健康状况和产奶质量检测

肢蹄病是养殖场的一种常见病。两年期间，未使用发酵床的样本肢蹄病统计发病率为25%，使用发酵床的样本统计发病率为3%。乳汁中的体细胞数（SCC）间接反映了牛奶品质及奶牛的健康状况，当SCC大于500 000 cells/mL时为隐形乳房炎［7］。在监测期间，应用发酵床养殖的奶牛平均产奶量为（32.5±0.2）kg/d，未使用发酵床样本产奶量（24.7±0.1）kg/d，两者差异显著（P＜0.05）。而发酵床养殖的奶牛生鲜乳SCC平均值为216 000 cells/mL，低于未使用发酵床的奶牛SCC平均值（269 000 cells/mL）。由此可见，应用发酵床管理降低了奶牛乳房炎和肢蹄病的发病概率。生鲜乳的微生物含量是评价其质量的一个重要指标。《食品安全国家标准 生乳》（GB 19301—2010）规定了生鲜乳中的细菌总数不得超过2×106CFU/mL。通过对比40份生鲜乳样本发现，使用稻壳和干牛粪渣为垫料，生鲜乳中细菌的菌落总数最少，其次是稻壳粉垫料和锯末。不同类型垫料对应的生鲜乳细菌数，见表2。后期试验围绕以稻壳和干牛粪渣为垫料的发酵床开展。

表2 不同类型垫料对应的生鲜乳细菌数（n=40）单位：×102 CFU/mL

2.3 两年期发酵床基本理化指标测定

奶牛养殖中发酵床的适宜湿度为55%～80%［8］。以稻壳和干牛粪渣为垫料的发酵床在使用2年后，发酵床含水量仍适宜，有利于微生物发酵分解牛粪，减少有害气体（H2S、NH3）产生。微生物代谢能是发酵床温度的主要来源［9］。微生物活动的核心层是发酵床中层，对应的温度高于对照组，差异显著。在经过2年使用后，处于稳定期的发酵床垫料pH值均在7.6左右，仍适宜微生物生长繁殖。表层垫料pH值略高于中层和深层，这与不同深度的微生物构成及其代谢产物有关，但未出现显著差异。垫料的pH值关系到垫料补充时机、翻动频率等日常管理和废弃垫料利用［10］。夏季是奶牛场有害气体浓度最高的季节，关系到牛场的空气质量，进而影响奶牛的生长及奶产品质量。试验组发酵床各层的氨气浓度显著（P＜0.05）高于对照组。在采用发酵床的牛场样本中未检出硫化氢。两年期发酵床不同深度样本的基本理化数据，见表3。

表3 两年期发酵床不同深度样本的基本理化数据

2.4 不同厚度发酵床的细菌分布规律

微生物发酵床厚度一般为60～100 cm，不同厚度和不同使用年限对发酵床内的微生物种类和数量均有影响［5］。该试验中，发酵床中层垫料的微生物菌落总数最高，数量级可达107～108，深层垫料中微生物存在量最小（P＜0.05），数量级维持在105～106。发酵床的菌群结构是基于Illumina Nova测序平台测序完成的。通过对Reads拼接，平均每个样品测得81 944条tags，经过质控平均得到78 396条有效数据，质控有效数据量达51 905，质控有效率达63.30%。以97%的一致性将序列聚类成 为OTUs（operational taxonomic units），共 得 到2 315个OTUs，有效碱基数为21 661 78 bp，序列平均长度为417.33 bp。如图1（a）所示，测得的物种数在A-K、B-K组间具有显著（P＜0.05）差异，显著性P值为0.024 2、0.024 2。 测得的物种数在C-K、A-C、B-C等组间不具有显著差异（P＞0.05），P值为0.118 2、0.337 1、0.337 1等。图1（b）中，Alpha多样性指数（Shannon）分别为A组6.69±0.521，B组6.997±0.101，C组6.445±0.290，K组5.747±0.445。多样性数据通过wilcox秩和检验在B-K、A-K组间具有显著（P＜0.05）差异，显著性P值为0.009 4、0.049 3，即5 cm和25 cm厚的发酵床细菌多样性最高，表层和中层的细菌群落结构差异显著。多样性指数在B-C、C-K、A-B等组间不具有显著差异（P＞0.05）。由于垫料表层易受奶牛粪便、环境等影响，垫料中层更能反映发酵床微生态结构。据报道，发酵垫料15～30 cm处为发酵核心区域，细菌代谢旺盛［11-12］，但垫料的微生物多样性会随着发酵床使用年限增加而降低［13］。在该研究中，两年期的发酵床微生物群落多样性仍略高于未发酵垫料。在细菌门水平上差异丰度比较分析显示（见图2），未发酵的垫料样本中放线菌门最多，占整个体系的42.6%，其次为变形菌门（23.3%）和厚壁菌门（23%）。随着发酵床厚度增加，变形菌门含量从49%降至32%，这与表层和中层垫料中有大量的动物粪便相关，该类细菌主要参与氮、硫等物质的转化。放线菌门主要活跃在表层（19.5%）和中层（21%），深层含量最少（6.4%）。垫料经过发酵可以有效减少放线菌门丰度，这与陈倩倩等［14］的研究结果一致。拟杆菌门在未发酵垫料中很少（1%），但随发酵床厚度增加呈现增多趋势，在表层占9.6%，中层14.5%，深层28.3%，该类细菌主要参与碳循环。厚壁菌门在各层发酵床的比例为表层12.2%，中层16%，深层19%。据报道，厚壁菌门中的芽孢杆菌属细菌和梭菌属细菌对垫料中有机质的降解具有重要作用［15］。笔者发现在属水平上有大量的细菌菌属（＞70%）还有待鉴定。

图1 发酵床不同深度样本的细菌差异分析图

图2 发酵垫料的门水平上的细菌构成

2.5 不同厚度发酵床的真菌分布规律

在真菌菌群结构分析中，平均每样品测得89 870条，经过质控平均得到81 613条有效数据，质控有效数据量达63 932，质控有效率达71.69%。以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为OTUs，共得到2 208个OTUs。通过对样品的复杂度分析，发现测得的真菌物种数随着发酵床深度增加有增多趋势。纤维素分解依赖于分解能力很强的真菌［12］，这也为参与碳循环的细菌生长提供了碳源。如图3所示，在C-K组间具有显著（P＜0.05）差异，显著性P值为0.016 3。测得的物种数在B-K、AC、A-K等组间不具有显著差异（P＞0.05），P值分别为0.062 3、0.151 0、0.186 9。反映Alpha多样性的Shannon指数在C-K、A-K、B-K组间具有显著（P＜0.05）差异，显著性P值分别为0.012 6、0.032 0、0.040 6，说明微生物的转化作用是发酵床的真菌多样性增加的原因之一。Shannon指数在B-C、AC、A-B组间不具有显著差异（P＞0.05），说明发酵床不同深度样品具有相似的真菌群落组成。结合物种数量和多样性指数值，发酵床的厚度对真菌结构影响不大（P＞0.05）。发酵后，真菌多分布在深层（P＜0.05）。经过LEFSe分析组间差异物种，将差异贡献值LDA大于4的物种选择为具有统计学差异的biomarker。笔者发现样品B组和K组间的差异特异物种共11个，结合它们的丰度信息和进化关系，有6个重要类别分别隶属毛壳菌科（Chaetomiaceae）、粪 壳 菌 纲（Sordariomycetes）、粪壳菌目（Sordariales）、曲霉菌科（Aspergillaceae）、散囊菌目（Eurotiales）和散囊菌纲（Eurotiomycetes）。在B、C组和K组间的差异物种共3个，分别隶属曲霉属（Aspergillus）、桃色顶孢霉（Acremonium persicinum）和马尔尼菲蓝状菌（Talaromyces marneffei）。

图3 发酵床不同深度样本的真菌差异分析图

2.6 发酵床微生物菌群代谢功能预测

根据细菌和真菌测序数据进行基于KEGG数据库和已有真菌环境功能数据库的功能预测，如图4所示，各组样本中相对丰度较高的细菌菌群功能相似，菌群代谢相关的通路约占50%，是有机质发酵降解的主力军，代谢旺盛。具有分解作用的腐生真菌多集中在发酵床深层，在C组中大约占8.2%，但大部分功能还有待注释。

图4 发酵床细菌Level1层级（a）和真菌（b）功能注释相对丰度柱形图

3 结论

发酵床是当今流行的一种环保型养殖模式，核心在于利用有益微生物的强大转化能力，实现养殖动物粪尿中的有机物完全降解，达到零排放的目的。一般发酵床主要由有机垫料组成，厚度根据养殖动物不同进行调整。在持续稳定运行两年后，以稻壳和干牛粪为垫料的发酵床的基础参数（温度、含水量、pH值、硫化氢等指标）仍能满足生产需要，细菌群落对整个发酵床的微生态系统影响很大。应用该发酵床养殖技术，生鲜乳品质和奶牛健康状况有所改善。