PGAM1和Ki67在脑胶质瘤中的表达及意义

周洲 张东宁 房程龙 朱崇田 陆玉成

(1 青岛大学第十一临床医学院(临沂市人民医院)，山东 临沂 276003；2 临沂市人民医院康复诊疗中心； 3 临沂市人民医院中心实验室)

脑胶质瘤起源于神经胶质细胞，是颅内最常见的原发性肿瘤，发病率占中枢神经系统恶性肿瘤的81%[1]。脑胶质瘤分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级，其中Ⅰ、Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别胶质瘤，脑胶质瘤级别越高，预后越差。高级别胶质瘤，尤其胶质母细胞瘤，具有高侵袭性、高复发率、高死亡率的特点，患者预后极差，5年生存率约为5.6%[1-4]。迄今为止，脑胶质瘤的治疗方法有手术切除、化疗、放疗、生物治疗及免疫治疗等。由于脑胶质瘤具有广泛侵袭的生物学特性，与周围组织边界不清，手术无法完全切除，复发率较高[5-7]。而辅助放疗和化疗技术，治疗效果也不尽人意[8-9]。此外，因脑胶质瘤的遗传异质性，新提出的免疫治疗和生物治疗对患者的生存率也无明显的影响[10]。因此，研究新的有效治疗方法是当务之急。磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)是糖酵解的重要酶，催化3-磷酸甘油酸(3-PG)生成2-PG，通过控制细胞内底物3-PG和产物2-PG的浓度反馈调控生物大分子物质的合成，在肿瘤的代谢和生物合成过程中发挥着重要作用[11]。研究证实PGAM1在人类多种肿瘤组织中表达上调，而且其表达水平与非小细胞肺癌、乳腺癌、宫颈癌、口腔鳞状细胞癌等患者的预后呈显著负相关[12-15]。Ki67是应用较广泛的细胞增殖标志物，存在于细胞核内，与细胞周期密切相关。目前研究发现随着脑胶质瘤病理级别的增高，Ki67蛋白的表达水平也逐渐增高[16]。目前国内外分别有PGAM1和Ki67在脑胶质瘤组织中表达的研究，但是关于PGAM1与Ki67在脑胶质瘤中的表达是否具有相关性及其具体调控机制尚未见相关报道。本研究应用免疫组织化学方法检测脑胶质瘤组织中PGAM1和Ki67表达水平，探讨两者的相关性及其与患者临床病理特征的关系，为寻找脑胶质瘤新的检测标志物及治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取2014年1月—2018年12月于临沂市人民医院神经外科行手术治疗并经病理检查确诊为脑胶质瘤的83例患者肿瘤组织标本(脑胶质瘤组)，同时选取10例来自于接受颅内减压手术的颅脑外伤或高血压脑出血患者的脑组织样本。脑胶质瘤组中男41例，女42例；年龄4～82岁，平均年龄48岁；按照WHO(2007年)中枢神经系统肿瘤病理分级标准，将脑胶质瘤组分为Ⅰ～Ⅱ级组26例，Ⅲ级组21例，Ⅳ级组36例。所有脑胶质瘤患者术前均未接受过放射化学治疗。本研究经过临沂市人民医院伦理委员会批准，患者或其亲属术前均签署知情同意书。

1.2 苏木精-伊红(HE)和免疫组织化学染色

术中收集的脑组织标本，常规石蜡包埋后，切片。按照常规方法进行HE染色，在光镜下观察组织标本的病理变化情况。免疫组织化学染色操作严格按照中杉免疫组化试剂盒(PV9003)说明书进行，一抗为PGAM1(1∶200，ab2220，美国Abcam公司)、Ki-67(1∶100，上海复申生物科技有限公司)，检测两组中PGAM1和Ki-67蛋白的表达情况。

1.3 结果的判读标准

针对两种染色结果均采用双盲法进行观察。其中免疫组织化学染色结果的判读参考相关文献标准[17]，以细胞质内呈黄色或棕黄色为PGAM1阳性表达，细胞核出现棕褐色或棕黄色颗粒为Ki67阳性表达。PGAM1综合评分包括细胞染色比例以及细胞染色强度两部分，细胞染色比例为染色细胞在细胞总数中所占的比例，分为0、1%～25%、26%～50%、51%～75%和>75% 5个等级，分别计为0、1、2、3和4分；细胞染色强度分为无、弱、中、强4个等级，分别计为0、1、2和3分。按照细胞染色比例和染色强度得分的乘积进行分组，乘积的分值≤3分为PGAM1低表达组，>3分为PGAM1高表达组；用阳性指数评估Ki67蛋白的表达情况并进行分组，阳性指数≥10%为Ki67高表达组，阳性指数<10%为Ki67低表达组。

1.4 脑胶质瘤组患者临床资料的收集以及患者的随访

收集脑胶质瘤组患者的临床资料，包括患者的性别、年龄及肿瘤原发位置。对脑胶质瘤患者本人或家属以电话、门诊方式进行随访，随访截至患者病逝或随访结束。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件进行统计分析，计数资料以率(X%)表示，计量资料以M(P25，P75)表示，脑胶质瘤组织中PGAM1、Ki67蛋白表达水平比较，及与各临床病理参数分析采用χ2检验或Fisher确切概率法检验。PGAM1高表达以及低表达组间Ki67蛋白的表达比较采用Mann-Whitney检验。同时采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，以Log-rank检验分析PGAM1和Ki67蛋白的表达与脑胶质瘤患者生存的相关性。以P<0.05表示差异具有显著性。

2 结 果

2.1 各组脑组织HE染色结果

对照组脑组织细胞密度均匀，层次分明，细胞核规则，胞浆无异常染色，无异型性细胞(图1A)；脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级组患者的脑胶质瘤细胞密度增加，细胞质着色，细胞核深染，轻度异型性(图1B)；Ⅲ级组患者脑胶质瘤细胞聚集，大小不一，排列紊乱，异型性更加明显(图1C)；Ⅳ级组患者脑胶质瘤细胞明显密集，核分裂象多见，可见微血管增生(图1D)。

A～D分别为对照组、Ⅰ～Ⅱ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组，PV9003法，200倍

2.2 PGAM1和Ki67在各组脑组织中的表达情况比较

免疫组织化学染色结果显示,PGAM1主要表达于细胞质中，Ki67定位于细胞核内。对照组和不同级别脑胶质瘤组中PGAM1表达比较差异有显著性(χ2=21.029，P<0.05)。不同级别脑胶质瘤组中Ki67表达比较，差异具有显著性(χ2=28.105，P<0.05)。见表1。

表1 PGAM1和Ki67在各组脑组织中表达情况比较(例)

2.3 脑胶质瘤组织中PGAM1、Ki67蛋白的表达与患者临床病理特征的关系

根据免疫组化染色结果，PGAM1高表达组患者42例，PGAM1低表达组患者41例；Ki67高表达组患者57例，Ki67低表达组患者26例。高级别(WHO Ⅲ～Ⅳ级)脑胶质瘤组织中PGAM1以及Ki67蛋白的表达显著高于低级别(WHO Ⅰ～Ⅱ级)脑胶质瘤组织(χ2=14.906、20.415，P<0.05)，而与患者性别、年龄以及肿瘤原发位置无关(P>0.05)。见表2。

表2 PGAM1和Ki67表达水平与患者临床病理特征的关系

2.4 脑胶质瘤组织中PGAM1以及Ki67表达的相关性

PGAM1高表达组和低表达组的Ki67阳性指数分别为5.0(0.0～15.0)、10.0(5.0～30.0)，两组间比较差异具有显著性(Z=-3.038，P<0.05)。

2.5 PGAM1和Ki67表达与脑胶质瘤患者生存时间的关系

Kaplan-Meier曲线显示，PGAM1与Ki67高表达、低表达组患者总生存期比较差异有显著性(P<0.05)。见图2。

图2 PGAM1和Ki67高表达、低表达组患者的生存曲线图

3 讨 论

脑组织主要依靠葡萄糖提供能量，在氧气充足时，葡萄糖经过氧化磷酸化产生大量的能量，并进行物质代谢，参与一系列细胞活动。在缺氧环境下，氧化磷酸化被抑制，脑组织细胞只能通过糖酵解产生能量供能。然而早期的研究发现，即使在氧气充足的条件下，一些细胞依然选择糖酵解途径进行能量代谢，经糖酵解代谢产生的丙酮酸并不进入线粒体进行氧化磷酸化，反而在细胞质内经代谢生成乳酸，这一现象被称为“有氧糖酵解”，也叫“Warburg效应”[18]。研究证实，Warburg效应是肿瘤的生物学特征，对肿瘤内Warburg效应的分子机制进行研究发现，肿瘤细胞糖酵解途径中的几种关键酶含量明显上升，通过调控细胞的能量和物质代谢来促进肿瘤的生长、浸润及转移[19-20]。

PGAM1为辅因子依赖型的单磷酸甘油酸变位酶，在糖酵解和磷酸戊糖途径中起着关键性作用。PGAM1由2个相对分子质量为30 000的亚单位B(脑型)组成的同二聚体，即BB-PGAM，最初在脑组织中被发现，后来证实在人类组织中广泛表达。多项研究表明，PGAM1在肿瘤组织中高表达，其表达水平与恶性肿瘤的临床分期以及预后有明显的相关性[15]。ZHANG等[15]发现PGAM1的表达与口腔鳞状细胞癌患者的淋巴结转移、肿瘤复发相关，且PGAM1是患者总体生存率(OS)和无病生存(DFS)的独立风险因素。LIU等[21]将PGAM1的表达程度与胰腺导管腺癌患者是否有肿瘤远处转移、组织分化程度、临床分期以及生存率的关系进行分析，结果表明，PGAM1表达水平越高，癌组织的分化程度越高，临床分期越高，患者的生存率越低，且远处转移的倾向性越高。PGAM1具有代谢酶和非代谢酶的双重作用。mTOR/HIF-1α通路可以转录激活PGAM1，活化的PGAM1通过其代谢酶作用促进Warburg效应，促使细胞增殖和肿瘤生长[12]。敲低乳腺癌细胞内PGAM1的表达后，底物3-PG累积，可竞争性结合磷酸戊糖途径的关键酶6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGD)，致使DNA的合成原料dNTP失衡，激活下游p53(p73)并作用于p21，后者可使APC/C-Cdh1复合物活化，导致DNA的同源修复(HR)过程失败，从而抑制肿瘤细胞的增殖[13]。此外，PGAM1通过其非代谢酶与α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)相互作用，在肿瘤的进展中起着关键作用[22]。最近，国内首先报道了PGAM1的一种新型变构抑制剂HKB99，具有抑制PGAM1代谢酶和非代谢酶活性的双重作用，进而抑制细胞的增殖和迁移[23]。PGAM1已成为肿瘤诊断与治疗的热点。

Ki67是一种细胞增殖相关蛋白，存在于除G0期之外的细胞周期中。在病理学中，Ki67阳性指数和有丝分裂指数可作为肿瘤组织病理学分级的指标[24]。Ki67在许多肿瘤中异常表达，可作为肿瘤复发的重要预后指标[25]。研究发现Ki67在脑胶质瘤组织中异常高表达，与脑胶质瘤的恶性程度和预后密切相关[26]。

既往研究发现，下调PGAM1表达后可导致细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，提示PGAM1可能在细胞周期的调控过程中发挥着重要作用。JUNG等[27]将可以通过血-脑屏障的Tat-PGAM1融合蛋白经腹腔注射到8周龄的雄鼠体内，3周后取其脑组织进行免疫组织化学检测，发现在Tat-PGAM1组下丘脑齿状回细胞内Ki67阳性增殖细胞数量和阳性核表达显著增加。REN等[28]也报道在肝癌的荷瘤小鼠中敲低PGAM1的表达后，Ki67阳性表达下降68%以上。但是，关于脑胶质瘤中PGAM1与Ki67表达的相关性及其意义的研究尚未见报道。

本研究结果显示，脑胶质瘤组织中PGAM1的表达明显高于对照组正常脑组织，高级别(WHO Ⅲ～Ⅳ)脑胶质瘤组织中的表达较低级别(WHO Ⅰ～Ⅱ)脑胶质瘤组织明显增高，这与先前的研究结果一致[29-30]。随着脑胶质瘤病理级别增高，Ki67蛋白的表达水平也逐渐升高，高级别(WHO Ⅲ～Ⅳ)脑胶质瘤组织中Ki67蛋白的表达水平显著高于低级别(WHO Ⅰ～Ⅱ)脑胶质瘤组织。将PGAM1和Ki67蛋白的表达与脑胶质瘤患者的临床病理特征进行相关性分析，结果表明PGAM1和Ki67蛋白表达与肿瘤病理分级具有相关性，与患者的年龄、性别及肿瘤原发位置无关。进一步分析显示，PGAM1高表达的脑胶质瘤标本中Ki67蛋白的表达水平更高。Kaplan-Meier分析显示，PGAM1和Ki67表达与脑胶质瘤患者的总生存期有关,提示PGAM1和Ki67可能是影响脑胶质瘤患者预后的重要因素，在脑胶质瘤的发生发展中可能起着协同作用。

综上所述，PGAM1和Ki67与脑胶质瘤病理分级密切相关，对脑胶质瘤的诊断、病理分级及预后评价有重要的参考价值。虽然脑胶质瘤在颅脑肿瘤中较为常见，但是其发病率远不及其他恶性肿瘤，由于本研究收集病理资料较少，也未对相关机制进行研究，因此，PGAM1对脑胶质瘤诊断的价值，及其与病理分级和Ki67的相关性还需进一步研究。